骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　惡性腫瘤的主要標(biāo)志是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移特性。上皮來源的腫瘤轉(zhuǎn)移時往往經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，即腫瘤丟失上皮之間的緊密連接獲得間質(zhì)樣的特征，具有較強(qiáng)的遷移侵襲能力。EMT的發(fā)生除了腫瘤本身的原因外，也與腫瘤的微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤的微環(huán)境主要由腫瘤及其周圍間質(zhì)組成，包括了趨化而來的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，目前認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)低轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞獲得高轉(zhuǎn)移能力的特性。而胃癌是所有上皮

2、腫瘤中與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)系最密切的腫瘤，并且有學(xué)者認(rèn)為骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞就是胃癌的起源細(xì)胞。因此，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胃癌間質(zhì)中起的作用具有重要的意義，這也將有助于深入地理解腫瘤微環(huán)境尤其是干細(xì)胞促進(jìn)胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。
　　【目的】
　　研究胃癌間質(zhì)中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制及調(diào)控的關(guān)鍵分子。
　　【方法】
　　1．通過密度梯度離心法，成功分離出人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀對干細(xì)胞分

3、子標(biāo)志物CD44、CD29、CD105、CD90、CD45、CD34、CD19、CD14及CD133進(jìn)行鑒定。通過成脂，成骨及成肌條件誘導(dǎo)分化液對骨髓干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，來鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力。
　　2．通過建立間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系，利用Transwell遷移模型及多向遷移模型等對腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞的相關(guān)作用進(jìn)行研究。采用光鏡、掃描電鏡及透射電鏡對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞及干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，觀察細(xì)胞發(fā)生上

4、皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化時內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。利用免疫熒光，westernblot等分子生物學(xué)手段鑒定上皮細(xì)胞表面蛋白E-cadherin，間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志vimentin、α-SMA及β-catenin等表達(dá)。
　　3．收集共培養(yǎng)體系中的條件培養(yǎng)液，利用其刺激腫瘤細(xì)胞，模擬旁分泌因子對腫瘤細(xì)胞的作用。利用Transwell遷移模型研究不同腫瘤細(xì)胞系MKN28、HepG2及MCF-7在旁分泌信號分子刺激下對腫瘤細(xì)胞遷移能力影響。通過提取RNA，利用A

5、ffymetrix人類表達(dá)譜芯片humangenomeU133Plus2.0技術(shù)研究在旁分泌因子刺激下，影響啟動和維持胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。應(yīng)用Real-timePCR、免疫熒光及westernblot鑒定旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)志及關(guān)鍵分子。通過提取核蛋白及胞漿蛋白，利用westernblot研究β-catenin與MMP-16在旁分泌刺激下的相互關(guān)系。
　　4．利用PKH-26標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞

6、與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，記錄并測量裸鼠移植瘤的生長速度，并通過組織學(xué)研究移植瘤的臟器轉(zhuǎn)移情況。利用激光共聚焦顯微鏡研究移植瘤中PKH-26標(biāo)記的胃癌細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上α-SMA、β-catenin及MMP-16的表達(dá)情況。
　　5．通過免疫組織化學(xué)技術(shù)在胃癌組織，包括原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶配對的胃癌組織，研究β-catenin及MMP-16表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性。
　　【結(jié)果】
　　1．成功利用梯度密度離心

7、法分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過貼壁法純化，流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD29、CD105及CD90陽性表達(dá)率在95％以上，而干細(xì)胞陰性標(biāo)志CD45、CD34、CD19、CD14及CD133表達(dá)均低于2％;結(jié)果證明培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。利用茜素紅-S、油紅等染料標(biāo)記出干細(xì)胞分化而來的礦化結(jié)節(jié)及脂滴，證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有定向成骨，成脂肪分化能力。同時在5-aza的刺激下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的肌管樣結(jié)構(gòu)

8、，細(xì)胞連接緊密，提示其也具有成肌細(xì)胞的分化能力。
　　2．利用新建立的多向遷移模型及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞存在緊密接觸時，腫瘤細(xì)胞可獲得間質(zhì)樣特征。而用Transwell小室將腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞分離，以及腫瘤細(xì)胞與其他成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)卻未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。掃描和透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞具有與成纖維細(xì)胞類似的結(jié)構(gòu)：波狀前緣、長突觸、大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體等，提示其分泌、運(yùn)動能力增強(qiáng)。通過免疫熒

9、光及westernblot研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中的胃癌細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志vimentin、α-SMA、β-catenin，同時下調(diào)上皮標(biāo)志E-cadherin等；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也高表達(dá)肌成纖維樣標(biāo)志vimentin及α-SMA，提示干細(xì)胞也獲得了肌成纖維細(xì)胞樣表型。
　　3．將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的條件培養(yǎng)液刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其具有類似上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，細(xì)胞分散，成梭形。去除條件培養(yǎng)的刺激后，間質(zhì)樣胃癌細(xì)胞又

10、重新聚攏恢復(fù)緊密接觸的特征；提示條件培養(yǎng)液可以刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。利用Transwell遷移模型發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)液可以促進(jìn)肝癌HepG2，胃癌MKN28及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的遷移能力，并且遷移的細(xì)胞也具有明顯的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征。免疫熒光及westernblot發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)液刺激的細(xì)胞，除間質(zhì)樣標(biāo)志性蛋白Vimentin，α-SMA上調(diào)，細(xì)胞膜表面蛋白E-cadherin下調(diào)外，β-catenin也從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。β-caten

11、in作為Wnt信號通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，提示條件培養(yǎng)液中旁分泌因子可以通過Wnt信號通路促使腫瘤細(xì)胞EMT。采用高通量的基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)液刺激后腫瘤細(xì)胞上調(diào)了113個基因，下調(diào)了115個基因。其中β-catenin下游基因MMP-16也被篩選到。條件培養(yǎng)液在促進(jìn)β-catenin入核表達(dá)的同時，也上調(diào)了MMP-16的表達(dá)并伴隨twist、snail等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的升高。
　　4．間充質(zhì)干細(xì)胞與胃癌細(xì)胞MKN2

12、8混合后種植到裸鼠皮下可以明顯的促進(jìn)胃癌增長，瘤重增加2.1倍到2.8倍。在激光共聚焦顯微鏡下可以發(fā)現(xiàn)在PKH-26標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞及胃癌細(xì)胞高表達(dá)α-SMA，表明二者均獲得了肌成纖維樣或間質(zhì)樣特征；同時胞漿及胞核中β-catenin的表達(dá)較單獨(dú)MKN28注射組明顯增強(qiáng)。通過PKH-26標(biāo)記還發(fā)現(xiàn)MMP-16隨著β-catenin表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)，表明β-catenin活化可以促進(jìn)MMP-16的表達(dá)。
　　5．β-catenin在1

13、94例胃癌中胞核表達(dá)占22.1％，胞膜及胞漿分別占34％和44.8％。MMP-16在194例胃癌中的陽性表達(dá)率為72.2％。隨著腫瘤浸潤程度的增加，β-catenin細(xì)胞膜的表達(dá)逐漸減少，T1、T2、T3表達(dá)率分別為100％、60.9％、39.5％（P=0.032）。統(tǒng)計未發(fā)現(xiàn)MMP-16與腫瘤TNM分期密切相關(guān)；但按照Lauren分型后，163例腸型胃癌中MMP-16的陽性表達(dá)率為76.1％明顯高于在彌漫型中的表達(dá)51.6％，P=0.

14、008。同時我們發(fā)現(xiàn)隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，MMP-16的陽性表達(dá)率逐漸增高，N0=65.9％、N1=75.8％、N2=92.6％，P=0.036。MMP-16陽性的胃癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相對危險度為6.67，95％可信區(qū)間為1.46-30.43。而遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相對危險度為12.8，95％可信區(qū)間為2.29-71。
　　【結(jié)論】
　　1．通過創(chuàng)建腫瘤與干細(xì)胞多向遷移等體外模型，率先發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

15、。這種轉(zhuǎn)化除有明確的蛋白標(biāo)志變化外，形態(tài)學(xué)上也能通過電鏡等進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的鑒定。
　　2．首次發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與胃癌細(xì)胞可以通過旁分泌信號起始和維持胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。這可能是旁分泌機(jī)制促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。
　　3．通過基因芯片技術(shù)我們篩選到靶分子基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-16。實(shí)驗(yàn)證明共培養(yǎng)模型中的旁分泌信號分子可以通過刺激β-catenin活化促進(jìn)MMP-16的表達(dá)。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)

16、腫瘤體內(nèi)增殖。PKH-26示蹤發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞直接分化為肌成纖維樣細(xì)胞參與腫瘤間質(zhì)構(gòu)成；同時也可以刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。上述現(xiàn)象地產(chǎn)生與β-catenin活化及MMP-16表達(dá)有關(guān)。
　　5．通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者中β-catenin膜型蛋白的丟失與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而MMP-16表達(dá)的上調(diào)是腸型胃癌淋巴及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的高危因素。上述研究提示β-catenin及MMP-16在胃癌轉(zhuǎn)移中起扮演重要角色，深入研究將有利于胃癌預(yù)警