超聲輻照微泡促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)急性腎小管壞死實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性腎功能衰竭(ARF)在臨床上是常見(jiàn)的急危重癥，尤其在重癥監(jiān)護(hù)室。大部分缺血和中毒所致的急性腎功能衰竭是可治的，但是，往往是伴有多器官衰竭的因素。實(shí)際上，盡管腎臟治療有了很大的發(fā)展，醫(yī)院內(nèi)獲得性急性腎功能衰竭的病死率并沒(méi)有明顯減少，仍高達(dá)30.80％。急性腎小管壞死(ATN)是缺血和中毒所致的急性腎功能衰竭的主要原因。因此，怎么能夠促進(jìn)ATN后對(duì)其修復(fù)與再生，從而到達(dá)使ATN的死亡率降低。
　　研究表明，生長(zhǎng)因子在ATN腎小管皮

2、細(xì)胞再生中起積極的作用。在動(dòng)物ATN的模型上，用如下的生長(zhǎng)因子治療：上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，可以改善其增殖再生，從而到達(dá)修復(fù)的目的。雖然在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子促進(jìn)ATN的再生和修復(fù)，但在人患有急性腎臟損傷后，用胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)其進(jìn)行治療，療效不佳。有學(xué)者推測(cè)，人體ATN的修復(fù)有著十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其修復(fù)可能涉及到腎微環(huán)境的網(wǎng)絡(luò)蛋白綜合作用，用單個(gè)基因產(chǎn)物來(lái)治療

3、作用非常有限。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多應(yīng)用于各種組織器官損傷的再生治療，為組織器官的修復(fù)開(kāi)辟了一條新的途徑。骨髓干細(xì)胞移植是治療ATN的一種新方法。骨髓干細(xì)胞在病理?xiàng)l件下會(huì)歸巢至腎小管損傷部位，并分化為腎小管皮細(xì)胞，促進(jìn)腎組織形態(tài)和功能改變。但是有一些學(xué)者持懷疑態(tài)度，認(rèn)為骨髓源性的間充質(zhì)干細(xì)胞不能轉(zhuǎn)化為腎小管上皮細(xì)胞。在參與腎損傷修復(fù)過(guò)程的間充質(zhì)干細(xì)胞中，骨髓源性的間充質(zhì)干細(xì)胞所占比例很少。用干細(xì)胞移植來(lái)

4、治療ATN并希望干細(xì)胞分化成腎小管上皮細(xì)胞的設(shè)想很難實(shí)現(xiàn)。因此，能改善骨髓干細(xì)胞移植治療ATN的方法嗎?干細(xì)胞植入的有效性及靶向性是干細(xì)胞移植治療ATN的關(guān)鍵。而細(xì)胞間黏附分子表達(dá)有利于干細(xì)胞的歸巢，提高干細(xì)胞移植的療效，為骨髓干細(xì)胞治療急性腎小管壞死提供了新的思路。
　　近年人們?cè)趪L試藥物及基因靶向釋放的新方法(超聲靶向破壞微泡)。超聲介導(dǎo)微泡破裂后產(chǎn)生有如下的生物效應(yīng)：內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞因子表達(dá)改變，中性粒細(xì)胞聚集，炎性反

5、應(yīng)等。感興趣的是，超聲輻照微泡后骨骼肌毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(ICAM-1)及血小板源生長(zhǎng)因子PDF表達(dá)增加。在后來(lái)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)超聲介導(dǎo)微泡后心肌組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1及ICAM-1)表達(dá)增加。而且應(yīng)用超聲介導(dǎo)微泡后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓干細(xì)胞到下肢缺血模型中及轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞到非缺血性心肌病，都取得了一定療效。后來(lái)應(yīng)用聚焦超聲及應(yīng)用診斷超聲介導(dǎo)微泡轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓干細(xì)胞到缺血性心臟病模型，也有同樣的效果。而未見(jiàn)

6、報(bào)道將超聲介導(dǎo)微泡的這種生物學(xué)效應(yīng)應(yīng)用于骨髓干細(xì)胞移植到腎臟模型是否也是一種可行的方法。因此，我們嘗試將超聲介導(dǎo)微泡轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓干細(xì)胞到大鼠ATN腎組織并促進(jìn)ATN修復(fù)研究。
　　超聲介導(dǎo)微泡的生物學(xué)效應(yīng)被廣泛的關(guān)注及研究，微泡的空化效應(yīng)可對(duì)周邊的毛細(xì)血管壁造成一些微觀的生物學(xué)反應(yīng)，包括微血管的滲漏、毛細(xì)血管破裂、誘導(dǎo)周邊細(xì)胞的凋亡及引起局部炎癥反應(yīng)等。盡管這些現(xiàn)象科發(fā)生在多個(gè)器官，但是腎臟似乎對(duì)上述的生物學(xué)效應(yīng)更加敏感，這可能與腎小

7、球毛細(xì)血管內(nèi)血壓較高有關(guān)，嚴(yán)重者可以引起持續(xù)出血，導(dǎo)致腎單位的損傷，甚至腎功能不全。因此，將超聲介導(dǎo)微泡的這種生物學(xué)效應(yīng)應(yīng)用于骨髓干細(xì)胞移植到腎臟模型，超聲輻照微泡的條件需要優(yōu)化。
　　針對(duì)上述理論及存在的問(wèn)題，本研究以二氯化汞(HgCl2)致大鼠急性腎小管壞死為模型，觀察不同強(qiáng)度超聲介導(dǎo)微泡后對(duì)腎組織微環(huán)境的影響，探尋合適超聲輻照條件以達(dá)到干細(xì)胞移植治療的目的。并在超聲輻照介導(dǎo)改善腎微環(huán)境后進(jìn)行4’，6-二脒基-2-苯基吲(DA

8、PI)標(biāo)記的干細(xì)胞移植治療，采用熒光顯微鏡觀察MSCs在腎組織的分布情況，熒光定量PCR測(cè)定基因表達(dá)水平，Western blot測(cè)定腎組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，HE染色觀察腎小管壞死后修復(fù)情況。共包括以下三個(gè)部分。
　　第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：探討一種體外分離、培養(yǎng)的高純度大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)方法并對(duì)其鑒定。
　　方法：為獲得高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞，采用如下方法：取大鼠脛骨

9、及股骨骨髓，通過(guò)密度梯度離心法分離出單一核細(xì)胞，再采用貼壁培養(yǎng)方法。采用免疫組化對(duì)CD34、CD31、CD44和CD45的細(xì)胞膜表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗原CD29及對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行周期測(cè)定。
　　結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果是分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞并貼壁。細(xì)胞鑒定結(jié)果是大鼠干細(xì)胞膜表面抗原陽(yáng)性的是CD44，表達(dá)陰性的是CD45、CD31和CD34；細(xì)胞周期檢測(cè)90.36％的細(xì)胞處在G0/G1期；流式檢測(cè)CD29陽(yáng)

10、性率是91.54％。
　　結(jié)論：通過(guò)Percoll分離液篩選，經(jīng)貼壁培養(yǎng)后獲得高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞，可為治療大鼠腎小管壞死提供充足的細(xì)胞來(lái)源。
　　第二部分：超聲輻照微泡對(duì)急性腎小管壞死腎組織微環(huán)境的影響
　　目的：探討不同條件超聲介導(dǎo)微泡對(duì)急性腎小管壞死腎組織的生物學(xué)效應(yīng)，選擇合適的超聲參數(shù)以促進(jìn)干細(xì)胞治療ANT。
　　方法：急性腎小管壞死模型的建立：腹腔注射HgCl2：(0.2％)的方法，劑量為0.75 mg

11、/kg。將HgCl2致急性腎小管壞死為模型的28只SD大鼠隨機(jī)分為4組：不采用超聲輻照第1組大鼠，作為對(duì)照組；第2、3、4組大鼠在腎小管壞死模型第1天及第3天后通過(guò)靜脈輸入微泡，采用頻率為1MHz，強(qiáng)度分別為0.5W/cm2、1.0W/cm2、2.0W/cm2的脈沖超聲經(jīng)腎區(qū)輻照大鼠腎組織，每次輻照1分鐘。第2次輻照后4天將大鼠處死，取腎組織，定量PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)及腫瘤壞死因子α(TNFα)基因

12、及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：熒光PCR結(jié)果顯示：2.0W/cm2組腎組織表達(dá)ICAM-1及TNFα較對(duì)照組分別增加約3.1倍及6.3倍；1.0W/cm2組表達(dá)ICAM-1及TNFα較對(duì)照組分別增加約2.9倍及3.5倍；2.0W/cm2組的超聲輻照腎組織表達(dá)TNFα較1.0W/cm2組明顯增加(P<0.05)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果表明強(qiáng)度為1.0W/cm2及2.0W/cm2的超聲輻照腎組織表達(dá)ICAM-1及TNFα較對(duì)照組明顯

13、增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：強(qiáng)度為1.0W/cm2的超聲介導(dǎo)破裂微泡作用于大鼠急性腎小管壞死模型，上調(diào)腎組織ICAM-1的表達(dá)水平及輕度炎性反應(yīng)，有利于干細(xì)胞的歸巢。
　　第三部分：超聲靶向破壞微泡誘導(dǎo)腎組織微環(huán)境改變聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)急性腎小管壞死修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討超聲靶向破壞微泡是否使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢于腎組織并促進(jìn)大鼠急性腎小管壞死修復(fù)。
　　方法：急性腎小管壞死模型的建立：腹腔注射

14、HgCl2：(0.2％)的方法，劑量為0.75 mg/kg。采用UGT1025型超聲輻照儀，強(qiáng)度為1.0W/cm2及頻率為1 MHz超聲照射腎臟組織，并尾靜脈輸入0.5 ml造影劑，濃度為1.0×108個(gè)/ml左右，輻照時(shí)間5s，停5s，總共1 min。在急性腎小管壞死模型的建立后第1d及3d分別輻照1次。將制備成功的40只腎小管壞死模型大鼠隨機(jī)分為4組(10只)，即：
　　(1)單純模型組(對(duì)照組)；
　　(2)1.0 W

15、/cm2超聲+微泡組(1.0US+MB)；
　　(3)干細(xì)胞組(MSCs)；
　　(4)1.0 W/cm2超聲+微泡+干細(xì)胞組(1.0US+MB+MSCs)。
　　最后一次輻照完畢后1 min內(nèi)經(jīng)股靜脈注入DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1ml(2.0×106個(gè)/ml)。7 d后將各組大鼠處死，取材用于熒光顯微鏡觀察MSCs在腎組織的分布情況，采用熒光定量PCR測(cè)定細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EG

16、F)及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因表達(dá)水平。采用Western blot測(cè)定腎組織中HGF及EGF蛋白表達(dá)水平，采用HE染色觀察腎小管壞死后修復(fù)情況。
　　結(jié)果：采用熒光顯微鏡觀察，DAPI標(biāo)記的MSCs細(xì)胞核(細(xì)胞核帶藍(lán)色熒光)，1.0US+MB+MSCs組腎組織骨髓干細(xì)胞數(shù)量明顯多于MSCs組(P<0.05)。熒光定量PCR結(jié)果表明1.0US+MB組及1.0US+MB+MSCs組ICAM-1的基因水平明顯高于對(duì)照組及MSCs組

17、(P<0.05)。1.0US+MB+MSCs組HGF及EGF基因水平明顯高于其他各組(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明1.0US+MB+MSCs組HGF及EGF蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各組(P<0.05)。HE染色結(jié)果表明1.0US+MB+MSCs組腎小管壞死修復(fù)情況明顯好于其他各組(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.0 W/cm2超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢于腎臟，并通過(guò)旁分泌或自分泌形式分泌HGF及E