外周血來源的成體干細胞的體外培養(yǎng)鑒定以及在皮膚創(chuàng)傷修復中的作用研究.pdf

1、除了骨髓組織，成人外周血中也存在著如造血干細胞（HSCs）和間充質(zhì)干細胞(MSCs)等多潛能干細胞成分。相對于骨髓的采集，外周血的干細胞采集具有供體創(chuàng)傷小、來源廣泛和自體取材無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點。近年來，循環(huán)間充質(zhì)干細胞（PeripheralBloodMesenchymalStemCells，PBMSCs）和循環(huán)成纖維細胞（CirculatingFibrocytes，CF）這兩種新型的多潛能成體干細胞在人類以及其他哺乳動物外周血中被發(fā)現(xiàn)

2、并鑒定，它們在機體組織器官的正常和非正常功能活動和創(chuàng)傷修復中發(fā)揮著重要的作用。
　　本研究著眼于應(yīng)用成體干細胞分離技術(shù)，在體外分離培養(yǎng)外周血來源的成體干細胞—循環(huán)成纖維細胞，觀察它們在體內(nèi)和體外的細胞增殖、分化、以及與多種皮膚組織細胞的相互作用；從細胞因子調(diào)控等多方面研究其作用機理，并將其應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷的修復過程，為組織工程皮膚的研究開辟了新的思路，更有助于提高組織工程皮膚產(chǎn)品的臨床應(yīng)用效果。
　　本研究主要分為四個部分

3、r>　　1.人外周血來源成體干細胞的體外培養(yǎng)和鑒定
　　目的：通過多種方法分離人外周血單個核細胞，在不同條件下獲得CF，研究了其細胞增殖特點和對其進行了詳細的鑒定。方法：采用淋巴細胞分離液(Percoll/Ficoll)分離含有外周血單個核細胞的白細胞群，直接體外培養(yǎng)或磁珠分選法分離單個核細胞進行培養(yǎng)，從而獲得CF細胞；通過不同細胞因子促進CF細胞增殖，比較效果；培養(yǎng)過程中描畫CF細胞生長曲線；應(yīng)用免疫組織化學方法和流式細胞儀對體

4、外培養(yǎng)的細胞進行鑒定。結(jié)果：通過分離成人外周血單個核細胞的方法可以獲得純度較高的CF細胞；在培養(yǎng)過程中應(yīng)用M-csf和TPO兩種細胞因子可以促進CF細胞的成熟和增殖；細胞生長曲線顯示經(jīng)過細胞因子的促進作用，CF細胞在體外培養(yǎng)過程中增殖速度加快。其中合適濃度的TPO的促進作用更為明顯且細胞轉(zhuǎn)化率低，是理想的促進CF細胞體外增殖的作用因子；免疫組織化學鑒定結(jié)果顯示，本實驗中體外培養(yǎng)獲得的貼壁纖維樣細胞表達CollagenⅠ且有Collage

5、nⅠ陽性的基質(zhì)分泌。流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的細胞其表面標志性抗原的表達隨著時間改變而不斷變化，但均符合CF細胞的特征。鑒定結(jié)果顯示獲得的細胞明確屬于CF細胞。
　　2.外周血來源成體干細胞在體外培養(yǎng)過程中的多向分化能力研究
　　目的：探討CF細胞作為一種多潛能成體干細胞其成骨、成脂和向神經(jīng)細胞分化的能力。方法：采用與雪旺細胞（Schwanncells，SCs）共培養(yǎng)以及直接添加細胞因子NGF的方法，促進CF細胞向神經(jīng)

6、細胞分化，通過免疫組織化學、Westernblot以及RT-PCR等方法對誘導的細胞進行鑒定；以添加地塞米松（dexamethasone，100nM）；β磷酸甘油鈉（β-glycerophosphate，10mM）；維生素C/抗壞血酸（Ascorbicacid，50μM）等試劑的培養(yǎng)基對CF細胞進行成骨誘導，通過大體形態(tài)和茜素紅染色鑒定誘導的細胞；以地塞米松（dexamethasone，1μM）、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3

7、-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素（insulin，10μg/ml）、吲哚美辛（Indomethacin，100mM）等試劑為活性成分的成脂誘導液，對體外培養(yǎng)的CF細胞進行成脂誘導，通過大體形態(tài)和油紅O染色鑒定誘導的細胞。結(jié)果：免疫組織化學染色結(jié)果顯示在兩種誘導條件下CF細胞均表達神經(jīng)標志物NSE和NF-H。westernblot和RT-PCR結(jié)果也顯示同樣的結(jié)果且共培養(yǎng)組的表達更強。成骨誘導結(jié)果細

8、胞茜素紅染色顯示陽性，顯示CF細胞在一定條件下具備成骨分化能力；油紅O染色結(jié)果顯示陽性說明CF細胞可以向脂肪細胞轉(zhuǎn)化。
　　3.體外觀察循環(huán)成纖維細胞對皮膚組織細胞的作用影響
　　目的：1）二維環(huán)境下通過共培養(yǎng)的方法觀察CF細胞對皮膚組織細胞的作用影響；2）三維條件下通過體外構(gòu)建復合CF細胞的組織工程人工皮膚，觀察CF細胞對皮膚組織細胞的作用影響。方法：1）以絲裂霉素C處理體外培養(yǎng)的原代CF細胞，使其成為類滋養(yǎng)層細胞；將體外

9、分離培養(yǎng)的真皮成纖維細胞（Fibroblasts，F(xiàn)Bs）和皮膚角阮細胞（Keratinocytes，KCs）與制備的類滋養(yǎng)層CF直接接觸共培養(yǎng)，通過直接光鏡觀察、MTT法、BrdU-ELISA摻入法、流式細胞儀分析細胞周期以及細胞運動（劃痕）實驗（Scratchassay）等手段觀察兩種皮膚組織細胞在體外的形態(tài)和增殖變化。2）體外構(gòu)建具有復合CF細胞的真皮層的組織工程人工皮膚，通過大體觀察，HE染色組織學觀察，Pan-CK免疫組織化學

10、染色等手段研究三維環(huán)境下CF細胞對皮膚組織細胞的作用影響。結(jié)果：1）絲裂霉素C處理后的CF細胞多次傳代后基本停止增殖，經(jīng)過與皮膚組織細胞的共培養(yǎng)后逐漸死亡；與類滋養(yǎng)層CF細胞共培養(yǎng)的FBs細胞形態(tài)基本沒有明顯變化，而KCs則形態(tài)變化明顯，出現(xiàn)表皮去分化特征性的細胞形態(tài)；MTT、BrdU-ELISA和流式細胞儀分析細胞周期顯示共培養(yǎng)后的FBs增殖加快，而KCs則增值速度減慢，提示CF細胞促進FBs的增殖作用和對KCs的抑制作用；細胞劃痕試

11、驗則顯示共培養(yǎng)后的FBs細胞移行能力加強，而KCs則呈現(xiàn)相反的趨勢。2）與具有單純復合成纖維細胞真皮的對照組相比，復合有CF細胞的真皮層的組織工程皮膚體外培養(yǎng)過程中體積收縮更為明顯，提示成纖維細胞增殖加速；但與正常對照組相比，其上皮化過程不良，角化層結(jié)構(gòu)較差。
　　4.循環(huán)成纖維細胞參與裸鼠皮膚創(chuàng)傷修復的實驗研究
　　目的：將體外分離培養(yǎng)獲得的人CF細胞通過循環(huán)途徑移植入裸鼠體內(nèi)，觀察其參與皮膚組織創(chuàng)傷修復的效果。方法：建立

12、裸鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型；體外以PKH26熒光染料標記體外培養(yǎng)的人CF細胞；鼠尾靜脈注射方法將標記好的人CF細胞移植入裸鼠創(chuàng)傷模型體內(nèi)，設(shè)立空白對照；大體觀察創(chuàng)面愈合情況，測量各組創(chuàng)面面積計算創(chuàng)面收縮率，3w左右采用抗人單克隆抗體（Pan-CK，α-SMA，Ⅷ等）對創(chuàng)傷部位皮膚組織進行取材免疫組織化學染色；定期取創(chuàng)面組織進行HE染色組織學觀察，冰凍切片進行熒光顯微鏡檢測PKH26陽性細胞。結(jié)果：實驗組和對照組裸鼠創(chuàng)傷皮膚均出現(xiàn)愈合，通過

13、大體觀察和計算創(chuàng)面收縮率結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的創(chuàng)面愈合快于對照組；實驗組愈合創(chuàng)面的上皮化較對照組好，血管生成更豐富；實驗組和對照組在各時間段均未在創(chuàng)面區(qū)域組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)PKH26陽性的細胞；抗人單抗免疫組織化學染色結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面區(qū)域在3w后各抗體均有表達，提示遷移至裸鼠皮膚創(chuàng)面參與修復的細胞可能來源于移植的人CF細胞。
　　綜上所述，CF細胞在體外來源廣泛，體外較易分離培養(yǎng)，通過某些細胞因子的作用可以有效促進其增殖。CF細胞作為一種創(chuàng)傷