腺病毒介導(dǎo)hTRX修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠急性放射損傷中的修復(fù)作用研究.pdf

1、急性放射損傷的防治一直是各國重點開展研究的領(lǐng)域。目前造血干細(xì)胞移植和造血生長因子的應(yīng)用仍是治療極重度骨髓型急性放射病的主要措施,但作用有限。因此,急需尋找新的預(yù)防或治療方法。硫氧還蛋白(TRX)具有清除自由基、抑制凋亡和促細(xì)胞生長等多重生物學(xué)作用,而間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá),且具有向照射后受損組織聚集的生物學(xué)特性。為此我們觀察了腺病毒介導(dǎo)hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)在急性放射損傷的NOD/SCID

2、小鼠中的修復(fù)作用。為基因修飾的MSC治療急性輻射相關(guān)性損傷提供了實驗依據(jù)。經(jīng)過相關(guān)文獻(xiàn)的檢索,目前尚未見國內(nèi)外有相關(guān)研究的報道。
　　第一,我們采用骨片消化結(jié)合細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)小鼠骨實質(zhì)MSC;采用膠原酶消化法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞表型,采用油紅染色鑒定成脂誘導(dǎo)情況;阿爾辛藍(lán)及甲苯胺藍(lán)染色檢測成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)情況;堿性磷酸酶染色及Von

3、Kossa染色檢測成骨細(xì)胞誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明,分離、擴(kuò)增培養(yǎng)的MSC細(xì)胞形態(tài)均一,其中小鼠骨實質(zhì)MSC高表達(dá)Sca-1、CD29和CD44,而不表達(dá)CD11b、CD117、CD34和CD45;hucMSC細(xì)胞高表達(dá)HLA-I、CD105、CD166、CD73及CD90,不表達(dá)CD31、CD14、CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR,符合MSC的表型特點。細(xì)胞周期檢測顯示,90％以上的細(xì)胞處于G0/G1期。在特定誘導(dǎo)條件下

4、,兩種MSC細(xì)胞均可向成骨、成軟骨及脂肪細(xì)胞分化。
　　第二,我們以hTRX為目的基因,設(shè)計含有NotI和EcoRV酶切位點的引物,PCR擴(kuò)增hTRX基因全長序列,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的pDC316-mCMV穿梭質(zhì)粒上,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP,同時選用不含目的基因的空腺病毒質(zhì)粒pAd316-EGFP作為對照。利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將AdMa

5、x腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,進(jìn)行同源重組,得到腺病毒重組質(zhì)粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包裝擴(kuò)增病毒,將獲得的病毒用氯化銫高速梯度離心、純化病毒,測定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對重組腺病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR和NotI、EcoRV酶切鑒定,證實含有hTRX基因,測序結(jié)果和TRX的理論序列一致。成功制備了純度

6、較高的病毒液,其中Ad-hTRX-EGFP病毒滴度達(dá)5.558×1010pfu/ml,對照病毒Ad-EGFP病毒滴度達(dá)3.1×1010pfu/ml。
　　第三,根據(jù)不同梯度的感染復(fù)數(shù)(MOI),我們檢測了重組腺病毒載體Ad-EGFP對小鼠骨實質(zhì)MSC的感染效率以及重組腺病毒載體Ad-hTRX-EGFP對293細(xì)胞和hucMSC的感染效率,用RealTimePCR檢測了細(xì)胞內(nèi)hTRX基因mRNA表達(dá),采用Westernblot檢測了

7、細(xì)胞內(nèi)hTRX蛋白的表達(dá)。并探討了感染hTRX基因?qū)ucMSC細(xì)胞周期及分化特性的影響。結(jié)果顯示,隨著MOI值的升高,感染效率逐漸提高,當(dāng)MOI=250時,Ad-EGFP對小鼠MSC的感染效率為46.78%;而當(dāng)MOI=100時,Ad-hTRX-EGFP對293細(xì)胞和hucMSC的感染效率分別為92.5%和95.22%。Westernblot檢測顯示,感染后的293細(xì)胞和hucMSC細(xì)胞內(nèi)hTRX蛋白量增高,hucMSC細(xì)胞內(nèi)hTRX

8、基因mRNA水平升高了10.52±3.21倍(P<0.05)。病毒感染后的hucMSC細(xì)胞周期顯示,93.2%的細(xì)胞處于G0/G1期。在特定誘導(dǎo)條件下,感染后的hucMSC細(xì)胞可向軟骨及脂肪細(xì)胞分化。說明感染hTRX對hucMSC的細(xì)胞周期及分化沒有影響。
　　最后,我們評價了hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在NOD/SCID小鼠急性放射損傷中的修復(fù)作用。將hTRX修飾的hucMSC通過尾靜脈輸注給經(jīng)4.5Gy全身照射的NOD/S

9、CID小鼠體內(nèi),并設(shè)置hucMSC治療組和單純照射組。通過觀察小鼠一般狀況和生存時間,檢測血常規(guī)、骨髓Lin-CD117+細(xì)胞比例和組織病理來評價治療效果。結(jié)果顯示,照射后第7天、第11天、第20天及第30天hTRX-hucMSC組小鼠的紅細(xì)胞及血紅蛋白顯著高于單純照射組和hucMSC組小鼠,其中第11天及第30天,hTRX-hucMSC組與其他兩組均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);而第7天及第20天僅hTRX-hucMSC組與單純照射

10、組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。雖然第7天、第20天及第30天hucMSC組小鼠的紅細(xì)胞及血紅蛋白也高于單純照射組,但二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。+30天hTRX-hucMSC組小鼠骨髓Lin-CD117+細(xì)胞比例明顯高于其他兩組,且均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。各組小鼠照射30天組織病理顯示,肝、脾和腸病理改變相對較輕微,而骨髓及肺臟病理改變顯著。單純照射組肝細(xì)胞輕度水腫,肝動脈及門靜脈充血,可見膽栓形成;脾臟可見血管充血及大量炎細(xì)胞

11、浸潤。hucMSC組和hTRX-hucMSC組肝脾病理表現(xiàn)較單純照射組略減輕。腸粘膜病理各組無明顯差異。單純照射組小鼠肺泡壁顯著增寬,血管顯著充血,出血,間質(zhì)水腫,透明膜形成,炎細(xì)胞浸潤顯著。hucMSC組小鼠肺泡壁增寬,血管充血,中等量炎細(xì)胞浸潤。而hTRX-hucMSC組小鼠肺泡壁間隔正常,少許血管充血,少量炎細(xì)胞浸潤。提示hTRX-hucMSC組小鼠肺損傷比其他兩組小鼠明顯減輕。單純照射組小鼠骨髓組織增生極度減低;hucMSC組小

12、鼠骨髓組織增生輕度減低;而hTRX-hucMSC組小鼠骨髓增生活躍。各組生存時間顯示,單純照射組小鼠生存時間為26±14.43d;hucMSC組為29.33±14.49d,生存時間較空白組延長,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.36),而hTRX-hucMSC組小鼠為56.67±5.25d。生存時間較前兩組顯著延長(P<0.01)。以上結(jié)果說明,hTRX通過保護(hù)了殘存的造血干細(xì)胞,特別是促進(jìn)紅細(xì)胞及血紅蛋白生成,來保證重要組織臟器的氧供應(yīng)。此外,