不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠放射性肺損傷的研究.pdf

1、放療是胸部腫瘤有效的治療手段,放射性肺損傷則是常見的并發(fā)癥。放射性肺損傷分為早期急性損傷及放療3個(gè)月后發(fā)生的晚期損傷,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至導(dǎo)致死亡。目前急性期損傷的治療多用大劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)癥處理,由此會(huì)引起糖尿病、股骨頭壞死等嚴(yán)重并發(fā)癥;晚期放射性肺損傷生過(guò)程相對(duì)緩慢,癥狀多在照射后3-6個(gè)月才明顯,此時(shí)肺放射性纖維化已形成,最佳治療時(shí)機(jī)已經(jīng)錯(cuò)過(guò),有效治療很少。如果有早期預(yù)測(cè)指標(biāo),及時(shí)采取措施,則可減少放射性肺炎的發(fā)生。目前臨

2、床急需預(yù)防及治療放射性肺損傷有效、低毒的手段,同時(shí)也需要有效、易行的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員,可取材于多種組織,包括小鼠骨片、骨髓、胚胎肺及背主動(dòng)脈區(qū)等部位,同時(shí)人源性MSC的研究也越來(lái)越多,如人臍帶、羊膜等來(lái)源。MSC在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下,可誘導(dǎo)分化為脂肪、軟骨、心肌以及肺上皮等多種組織細(xì)胞,其免疫調(diào)控作用也受到重視。
　　本研究目

3、的是分離、培養(yǎng)出鼠源及人源不同取材部位的MSC,并將MSC輸注給放射性肺損傷的小鼠模型,在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比療效,探索多種觀察指標(biāo),為MSC用于放射肺損傷的臨床治療提供參考。
　　一、本研究首先從小鼠骨髓、胚肺及胚胎背主動(dòng)脈區(qū)分離、培養(yǎng)MSCs,比較MSC對(duì)小鼠放射性肺損傷的治療作用。將25只8-10周齡C57BL/6雌鼠分為5組:正常組、單照組、骨髓MSC治療組、胚肺MSC治療組、胚胎背主動(dòng)脈(DA)區(qū)來(lái)源MSC治療組,觀察照射后5

4、個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(照射后4周、9周、13周、17周、23周)各組小鼠外觀、肺組織的病理變化。小鼠胸部照射劑量為單次18Gy。結(jié)果:小鼠外觀評(píng)分均值順序?yàn)檎＝M(10±0分)、DA組(8±0.71分)、胚肺組(7.6±0.57分)、骨髓組(6.1±1.75分)、對(duì)照組(4.8±0.84分),正常組明顯好于各組,均為p<0.01,單純放療組明顯差于DA組、肺MSC組,均為p<0.01。DA組、肺MSC組及骨髓組的兩兩配對(duì)t檢驗(yàn)均為p>0.05。

5、肺病理鏡檢肺損傷評(píng)分均值由好到差的順序?yàn)?正常組(0.12±0.16)、肺MSC組(0.22±0.1)、骨髓MSC組(0.33±0.18)、DA組(0.35±0.18)、對(duì)照組(0.54±0.27)。肺病理圖像分析肺間質(zhì)面積所占比例由好到差順序?yàn)?正常組(64.3±1.6)、肺MSC組(76.1±2.8)、DA組(76.8±3.3)、骨髓MSC組(77.2±2.7)、對(duì)照組(80.8±3.5)。外觀評(píng)分與病理鏡檢的相關(guān)性檢驗(yàn)p=0.04

6、0,與圖像分析的相關(guān)性檢驗(yàn)p=0.039。結(jié)論:不同鼠源MSC均有減輕放射性肺損傷的作用,其作用效果相似,胚肺、DA區(qū)來(lái)源的略好。
　　二、本部分研究對(duì)鼠源MSC的治療作用進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)檢測(cè)了血液及肺組織的指標(biāo)。將40只8-10周齡C57BL/6雌鼠隨機(jī)平均分為4組(正常對(duì)照組、單純照射組、胚肺MSC治療組、DA區(qū)MSC治療組),在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(4、8周)檢測(cè)。小鼠胸部照射劑量為單次18Gy。觀察小鼠外觀并評(píng)分,光鏡下觀察肺損傷情況

7、。用ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中TGF-β、IL-6的水平,并檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸的含量。結(jié)果:外觀評(píng)分第4周時(shí)各組無(wú)顯著差別,第8周時(shí)差別顯著,其中正常組9.6±0.9,明顯好于DA組(7.6±0.9,p=0.008)、胚肺組(7.8±0.4,p<0.001)、單照組(6.6±0.5,p<0.001),單照組差于DA組(p=0.066)、胚肺組(p=0.005),DA組與胚肺組相似(p=0.374)。病理檢測(cè)評(píng)分第4周正常組0±0,明顯

8、好于DA組(0.19±0.05,p<0.01)、胚肺組(0.29±0.22,p=0.019)、單照組(0.38±0.35,p<0.001);第8周正常組為0.06±0.08,明顯好于DA組(0.26±0.17,p=0.044)、胚肺組0.23±0.10,p=0.016)、單照組(0.30±0.18,p=0.025)。胚肺組、DA組、單照組的病理評(píng)分組間比較在第4周、第8周均無(wú)顯著差異。IL-6水平(pg/ml)正常組(489.3±75.

9、3、421.2±80.1)、單照組(437.9±87.1、398.1±116.3)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較及組間比較均無(wú)顯著差別。TGF-β1水平(pg/ml)正常組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為20.2±12.8、16.3±4.6,p=0.542;DA組值有下降,分別為27.5±13.5、12.4±2.6,p=0.039;胚肺組分別為15.5±8.4、28.3±18.4,p=0.194;單照組分別為9.0±2.8、31.5±27.9,p=0.110。小鼠

10、肺的羥脯氨酸含量(ng/ml)各組間差別不明顯,各組4周時(shí)含量明顯低于8周時(shí)含量,正常組分別為812.9±68.4、1080.8±189.5,p=0.018;DA組為823.3±14.6、1266.4±76.9,p<0.01;胚肺組為796.2±62.7、1234±153.9,p<0.001;單照組為839.0±17.0、1260.9±218.0,p=0.003。結(jié)論:小鼠不同來(lái)源MSC對(duì)放射性肺損傷有治療作用,外觀評(píng)分差異明顯,病理評(píng)

11、分中僅正常組顯著好于其他組,其他各組間比較差異不顯著,TGF-β1及IL-6檢測(cè)有待進(jìn)一步研究,羥脯氨酸水平隨時(shí)間的變化明顯升高,反應(yīng)了肺損傷后期纖維化情況。
　　三、分離、培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amnion MSC,AMSC)及臍帶(umbilical cord MSC,UMSC),并進(jìn)行表型鑒定。分別將AMSC及UMSC移植給胸部照射的小鼠觀察療效。共46只8-10周齡C57BL/6雌鼠分為4組、兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(7周及11周),

12、正常對(duì)照組11只(5+6)、單純照射組(5+6)、人羊膜MSC治療組(AMSC組)(7+8)、人臍帶MSC治療組(UMSC組)(4+5)。小鼠胸部劑量為單次20Gy。通過(guò)外觀及病理表現(xiàn)比較各組的損傷情況,并用CBA法檢測(cè)血漿中不同時(shí)間點(diǎn)的多種細(xì)胞因子,包括IL-6、IL-10、MCP-1等。結(jié)果:移植了人源MSC的小鼠均未出現(xiàn)意外死亡或其他不良事件,表明人源MSC對(duì)小鼠有很好的安全性。照射后第7周、11周外觀評(píng)分正常組為9.8±0.4及

13、10±0,明顯好于單照組8.2±0.4及8.0±0、AMSC組8±0.6及7.8±0.5、UMSC組8.3±0.5及8.0±0.5。單照組、AMSC組及UMSC組間無(wú)顯著差別。第7周、11周病理鏡檢評(píng)分正常組0.06±0.05及0.12±0.05、UMSC組0.11±0.01及0.12±0.04、AMSC組0.14±0.09及0.14±0.06、單照組0.18±0.06及0.19±0.08,統(tǒng)計(jì)學(xué)均無(wú)顯著差別。
　　正常組的6種血

14、漿細(xì)胞因子水平第11周與第7周相比均無(wú)顯著差別。受照射的各組有多種細(xì)胞因子在第11周的血漿水平明顯低于第7周的水平。第7周單照組的血漿細(xì)胞因子水平均明顯升高于正常組,第11周各組間血漿因子水平均無(wú)顯著差別。細(xì)胞因子水平的變化表明除正常組外,各組均出現(xiàn)了炎性反應(yīng)。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn):1.用外觀評(píng)分、肺組織病理及圖像分析等綜合方法判斷小鼠肺損傷程度。2.發(fā)現(xiàn)鼠源MSC對(duì)放射性肺損傷有明確的治療作用。3.人源MSC移植于普通的C57B