骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對高氧誘導(dǎo)小鼠肺損傷的治療研究.pdf

1、支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)又叫慢性肺疾病(Chronic lung disease，CLD)，是以慢性呼吸窘迫及肺功能不良為主要特征的疾病，隨著超早產(chǎn)兒（extremly preterm，胎齡24周至27+6周）及極早產(chǎn)兒（verypreterm，胎齡28周至32周）救治成功率及新生兒存活率的提高，BPD的診斷率及發(fā)生率也有逐漸增加的趨勢，尤其在極低出生體重兒(VLBW)人群中的發(fā)生

2、率高達(dá)20～40％。BPD發(fā)生于新生兒時(shí)期，病程長，對大部分患者來說，可伴隨終身，嚴(yán)重影響生命安全及生活質(zhì)量。臨床上常見于新生兒，尤其早產(chǎn)兒發(fā)生呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome，RDS）、吸入綜合癥、新生兒肺炎等疾病后，表現(xiàn)出呼吸增快、低氧血癥、酸中毒、三凹征、發(fā)紺等呼吸衰竭癥狀，給予呼吸支持治療之后，較長時(shí)期不能脫氧甚至依賴呼吸機(jī)。患者于新生兒時(shí)期即出現(xiàn)生長緩慢或停滯，病程短者數(shù)周內(nèi)死亡，即使

3、存活，遷延至數(shù)月至數(shù)年，對呼吸系統(tǒng)的損害也將伴隨終身，再次住院率極高，多合并肺功能障礙，死因常為肺部感染、心肺功能不全等。典型臨床病理表現(xiàn)為:早期出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，間質(zhì)及血管周圍水腫，細(xì)小支氣管損傷壞死，鱗狀上皮細(xì)胞化生，纖毛上皮細(xì)胞凋亡壞死，平滑肌增生肥厚;病程進(jìn)展很快，隨后即出現(xiàn)炎癥細(xì)胞侵潤，巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、纖維母細(xì)胞增加，纖維組織增生，膠原沉積，間質(zhì)增厚，支氣管細(xì)小支氣管受損阻塞，肺泡數(shù)目減少，彈力纖維變性

4、，肺部血管內(nèi)膜增厚，各級支氣管內(nèi)壁增厚，腺體增生，發(fā)展為局部肺不張及肺氣腫。
　　 BPD是一個(gè)多因素致病的綜合征，基本可以概括為:在肺組織發(fā)育不成熟的基礎(chǔ)上，氧中毒、氣壓傷、容量傷以及炎癥因素引起的肺泡化進(jìn)程阻滯，導(dǎo)致肺失去正常結(jié)構(gòu)及正常的呼吸功能。呼吸系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育分為胚胎期和出生后兩個(gè)時(shí)期。胎齡24周肺的發(fā)育進(jìn)入小管期，開始形成終末囊泡（肺泡前體）、細(xì)支氣管、毛細(xì)血管前體、粘液腺、支氣管等主要支架性結(jié)構(gòu)。胚胎28周以后，肺

5、進(jìn)入囊期，形成肺泡，并開始分泌肺表面活性物質(zhì)，具有呼吸功能的肺開始形成。但肺泡完全的發(fā)育與功能的成熟，要到8歲左右才能完成。因此，任何能夠阻滯這個(gè)過程的因素，均能導(dǎo)致對肺結(jié)構(gòu)的破壞及功能的嚴(yán)重影響，尤其在新生兒階段，所有能造成肺損傷、阻礙肺發(fā)育正常過程的因素，均能成為BPD的病因。小鼠肺組織的發(fā)展具有類似的時(shí)序性:假腺體時(shí)期肺基本支架，即各級主支氣管形成;小管期上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)展，細(xì)支氣管、毛細(xì)支氣管開始發(fā)育，并伴隨附屬微血管形成;囊泡期

6、為肺泡前體細(xì)胞形成時(shí)期，即肺泡化時(shí)期;最后是21日齡以后的肺泡成熟期。不同的是，人類在胚胎時(shí)期已完成肺的大體結(jié)構(gòu)和基本功能結(jié)構(gòu)的發(fā)育，如肺泡在小管期已經(jīng)開始少量發(fā)育，胎齡28周以后肺泡正式發(fā)育形成，而新生小鼠的肺組織僅完成了其大體形態(tài)的建立，肺泡化的完成主要發(fā)生于出生后直到生后21天。因此小鼠可較好地成為BPD的研究工具。目前在研究肺損傷的動物實(shí)驗(yàn)中，主要有以下幾種造模手段:博來霉素誘導(dǎo)、脂多糖誘導(dǎo)、石棉誘導(dǎo)、輻射誘導(dǎo)、高氧暴露誘導(dǎo)等，

7、其中高氧暴露是BPD起決定性作用的危險(xiǎn)因素，因此我們采取高氧暴露的方法制作小鼠BPD模型。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSC)是來源于骨髓基質(zhì)的干細(xì)胞，屬于非造血干細(xì)胞，對后者具有機(jī)械支持的作用，并通過分泌多種生長因子支持其造血功能。最重要的是，BMSC具有多向分化潛能，包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞;在一定的誘導(dǎo)條件下，還可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、

8、肺泡上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等內(nèi)臟細(xì)胞。同時(shí)BMSC具有MHC1+、MHC2-、CD40-、CD80-等免疫表型，但均不具有免疫原性;通過激活誘導(dǎo)外周T細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。綜上所述，BMSC具有多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)作用，且不具免疫原性，同種異體移植不會產(chǎn)生免疫抑制，因此有理由認(rèn)為，BMSC對組織損傷、免疫缺陷性疾病可以發(fā)揮治療作用。BMSC獲取較簡單，無論是動物實(shí)驗(yàn)，還是臨床自體取材，BMSC體外培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞同質(zhì)性可高達(dá)

9、95％以上，能保證細(xì)胞特性的穩(wěn)定遺傳，經(jīng)過特定的誘導(dǎo)刺激，仍具有多向分化的功能，培養(yǎng)及純化技術(shù)易于操作，成本低廉，因此BMSC具有廣闊的應(yīng)有前景。文獻(xiàn)報(bào)道BMSC在器官再生修復(fù)中，能通過誘導(dǎo)分化達(dá)到良好的效果。在一些急性肺損傷動物模型的治療研究中，證實(shí)外源性BMSC能減輕肺部炎癥反應(yīng)，改善急性炎癥引起的膠原蛋白的沉積;在各種慢性肺損傷、肺纖維化的動物模型的治療實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)了外源性BMSC的移植，能使受體肺部結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，能促進(jìn)Ⅱ型肺泡

10、上皮細(xì)胞的增生，改善肺纖維化的程度。通過不同的給藥途徑的研究，有些研究者認(rèn)為BMSC通過遷移、分化潛能達(dá)到對損傷肺的靶向修復(fù)，還有研究者認(rèn)為BMSC通過旁分泌的方式達(dá)到對損傷肺的修復(fù)。
　　 基于上述發(fā)現(xiàn)，我們將新生小鼠暴露于60％氧，對照組小鼠暴露于21％氧（空氣），對一般情況、體重等進(jìn)行觀察與記錄，至21日齡時(shí)取小鼠肺組織檢測。在飼養(yǎng)小鼠制作BPD模型的過程中，我們發(fā)現(xiàn)，包括健康小鼠（即空氣對照組小鼠）在內(nèi)，小鼠在生后前3天

11、內(nèi)體格生長較為緩慢，在整個(gè)21天喂養(yǎng)周期內(nèi)，高氧暴露組與空氣對照組的小鼠都表現(xiàn)出了體重增長:高氧組2日齡、7日齡、21日齡體重分別為(5.75±0.13)g、(8.14±0.18)g、(21.02±0.22)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3168，P=0.000)，空氣組2日齡、7日齡、21日齡體重分別為(6.09±0.15)g(8.92±0.16)g、(27.74±1.27)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3045，P=0.000);但高氧暴露

12、組小鼠體重總體上低于正?？諝鈱φ战M:2日齡，高氧組:(5.75±0.13)g，空氣組:(6.09±0.15)g，7日齡，高氧組:(8.14±0.18)g，空氣組:(8.92±0.16)g;t分別為6.698，12.497，20.156，P均為0.000，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨著日齡增加，逐漸差異增大，21日齡2組小鼠體重，高氧組:(21.02±0.22)g，空氣組:(27.74±1.27)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.156，P=0.

13、000）;同時(shí)高氧暴露組小鼠缺乏活力，一般情況較差，7日齡高氧暴露組與空氣對照組已出現(xiàn)較為明顯的差異，高氧組小鼠皮下脂肪不如對照組豐滿，反應(yīng)一般，離氧不耐受，皮毛較粗糙，而對照組正常生長，較活潑;21日齡高氧組體格較小，吃奶差，皮毛粗糙，拱背，歪頭，呼吸時(shí)可聞及鼻音，離氧或低梯度氧療下明顯不耐受，出現(xiàn)呼吸急促、皮膚發(fā)紺、蒼白，甚至痙攣，而對照組正常生長，活潑好動。這和人類BPD嬰兒營養(yǎng)不良較為符合，隨著肺泡化的阻滯，氣體交換不能滿足機(jī)體

14、對氧的需求，不能完成正常的新陳代謝，同時(shí)活性氧的細(xì)胞毒性也對細(xì)胞代謝造成損害，導(dǎo)致營養(yǎng)不良與生長受限。高氧組肺組織P2、P7、P21均出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性改變。2日齡的高氧組與空氣組相比，形態(tài)上未見明顯的量化改變，僅見遠(yuǎn)端過度充氣的肺泡或者間質(zhì)組織較肥厚。而7日齡高氧組小鼠的增大的肺泡增多，肺實(shí)質(zhì)出現(xiàn)局灶性增厚。隨著病情的進(jìn)展，至21日齡，即P21，高氧暴露組小鼠已經(jīng)表現(xiàn)出類似人類新生兒BPD的組織病理特征。進(jìn)行RAC的量化評估發(fā)現(xiàn)，2日齡兩組R

15、AC計(jì)數(shù):空氣組3.77±0.12、高氧組3.61±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.729，P=0.001);7日齡兩組RAC計(jì)數(shù):空氣組6.75±0.14、高氧組4.58±0.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.492，P=0.000);21日齡兩組RAC計(jì)數(shù):空氣組12.82±0.11、高氧組8.67±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為t=100.686，P=0.000）。因此肺泡增大，肺表面積減少導(dǎo)致氧交換及動脈氧合減少，導(dǎo)致B

16、PD肺功能障礙的發(fā)生。
　　 我們從雄性小鼠四肢骨髓腔分離出細(xì)胞，通過貼壁培養(yǎng)、純化，得到BMSC。從小鼠股骨骨髓采集的原代BMSC尚未純化，細(xì)胞核難以辨認(rèn)，各系細(xì)胞混雜，BMSC透亮圓形，大小不等;培養(yǎng)24小時(shí)后光學(xué)顯微鏡下觀察見少量圓形或不規(guī)則細(xì)胞貼壁，隨后48～72h貼壁細(xì)胞增多，小集落形成，細(xì)胞生長較緩慢，形態(tài)不均一、散落分布，可見球形、橢圓形、梭形細(xì)胞，其中拉長梭形細(xì)胞逐漸占優(yōu)勢;培養(yǎng)接近1周時(shí)間，細(xì)胞生長加快，約1周

17、后，經(jīng)過換液棄懸浮細(xì)胞，純化過程基本完成，貼壁的細(xì)胞形態(tài)均一，胞體增大呈紡錐形、梭形;換代培養(yǎng)的細(xì)胞生長迅速，形態(tài)進(jìn)一步拉長呈長梭形，融合度高，緊密貼壁，呈旋渦狀沿胞體長軸排列;消化后呈小而飽滿的圓形。流式細(xì)胞檢測顯示分離培養(yǎng)的BMSC均一性良好。通過對細(xì)胞表面免疫表型的分析，CD105、CD106顯示陰性對照與實(shí)驗(yàn)組呈雙峰波形，CD34、CD45兩封疊加重合，表明BMSC細(xì)胞群對CD105、CD106呈陽性反應(yīng)，對CD34、CD45呈

18、陰性反應(yīng)，提示BMSC分離培養(yǎng)成功。BMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，1周后逐漸形成鋪路石狀細(xì)胞形態(tài)，并逐漸形成局部重疊，形成多個(gè)結(jié)節(jié)的礦鹽沉積，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，逐漸融合;2周后形成棕褐色結(jié)節(jié)礦化中心，隨著時(shí)間延長，可融合成片。BMSC經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)約1周后，細(xì)胞呈無序排列，胞漿內(nèi)可見細(xì)小脂滴，隨著時(shí)間推移，脂滴增大，可推擠細(xì)胞核，折光度高，甚至肉眼可見呈白色的脂肪細(xì)胞集落。說明在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSC具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞定向分化

19、的能力。將BMSC與高氧損傷肺組織共培養(yǎng)，Real time qPCR檢測可見SP-C表達(dá)，熒光顯微鏡下可見Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)，而單獨(dú)培養(yǎng)、與正常對照組小鼠肺組織共培養(yǎng)則未見上述表達(dá)。BMSC與高氧損傷肺組織共培養(yǎng)后，激光共聚焦顯微鏡下可見出現(xiàn)微細(xì)絲的再生修復(fù)，表明損傷肺可促進(jìn)BMSC的體外遷移，而單獨(dú)培養(yǎng)、與正常對照組小鼠肺組織共培養(yǎng)則未見上述表達(dá)。BPD模型小鼠肺組織的原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺泡部位，以及植入BMSC的呼

20、吸道的周圍Y染色質(zhì)染色的存在，而PBS對照組則無類似發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表面，腹膜內(nèi)外源性BMSC具有向損傷肺轉(zhuǎn)移的能力。免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)，與陰性對照組相比，使用BMSC干預(yù)治療的BPD小鼠肺中SP-C與BMSC都有表達(dá)，表明外源性BMSC能提高AEC2在損傷肺中的含量?？諝鈱φ战M（陰性對照）、BMSC干預(yù)治療的高氧暴露組、PBS干預(yù)的高氧暴露組（陰性對照）小鼠肺組織SP-C通過real time qPCR檢測的表達(dá)量也顯示:空氣對照組（

21、陰性對照）與BMSC干預(yù)治療的高氧暴露組的SP-C表達(dá)量較高，分別為4.72±1.15、4.45±1.18，PBS干預(yù)的高氧暴露組（陰性對照）表達(dá)量低，為1.77±1.54，總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.407，P=0.000);空氣對照組與BMSC治療組的SP-C表達(dá)量較高(P=0.581)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSC治療組的SP-C表達(dá)量比PBS陰性對照組高(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺組織病理表現(xiàn)為:空氣對照

22、組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)規(guī)整，肺泡數(shù)量較多，大小均勻，肺間隔較薄;高氧暴露組注射PBS陰性對照組小鼠肺組織，表現(xiàn)為正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔隙增大，數(shù)量少，肺泡融合，肺間隔較厚，高氧暴露組注射BMSC的小鼠肺肺部結(jié)構(gòu)接近空氣對照組。RAC結(jié)果顯示，與PBS陰性對照組相比，高氧暴露組小鼠腹膜內(nèi)注射BMSC的BPD小鼠肺泡化增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.257，P=0.000);組間兩兩比較顯示，BMSC治療組與空氣組接近(P=0.404)，差

23、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BMSC治療組與PBS對照組有差異(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示BMSC對高氧肺損傷有修復(fù)作用。肺組織經(jīng)天狼星紅染色及Masson染色結(jié)果顯示，空氣對照組肺部結(jié)構(gòu)正常，肺泡大小正常均一，肺間質(zhì)厚度適中;高氧暴露注射PBS對照組小鼠肺組織失去正常結(jié)構(gòu)，肺泡腔隙擴(kuò)大融合，肺間質(zhì)增厚不規(guī)則，見藍(lán)色膠原沉積，并融合成片狀、束狀;高氧暴露注射BMSC治療組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)不如正常肺組織規(guī)整，有正常肺泡，肺間質(zhì)較厚，有部分

24、線條狀藍(lán)色膠原沉積，說明高氧暴露對肺組織結(jié)構(gòu)的損傷是顯而易見的，BMSC治療能顯著改善支氣管和肺泡周圍纖維組織增生的嚴(yán)重程度;提取3個(gè)不同處理組（即BMSC治療組、空氣對照組、PBS處理對照組）小鼠肺組織，經(jīng)提取RNA-反轉(zhuǎn)錄-real time qPCR以及血清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果分別顯示，BMSC治療的細(xì)胞外基質(zhì)重塑和纖維化相關(guān)的基因，即TGFβ1、TIMP-1、膠原1α等的表達(dá)顯著性減少: TGFβ1三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

25、義(F=53.443，P=0.000)，組間多重比較，BMSC治療組表達(dá)量接近空氣對照組（P=0.388），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSC治療組、PBS對照組比較有差異（P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TIMP-1:三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=88.195，P=0.000)，組間多重比較，空氣對照組、BMSC治療組接近（P=0.100），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSC治療組、PBS對照組比較有差異(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;

26、膠原1α:三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.917，P=0.000），組間多重比較，空氣對照組、BMSC治療組比較有差異（F=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSC治療組、PBS對照組比較有差異（P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血清中IL-1、TNFα降低:IL-1:三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.285，P=0.000)，組間多重比較，空氣對照組、BMSC治療組比較有差異(P=0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMS

27、C治療組、PBS對照組比較有差異(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TNFα:三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.768，P=0.000)，組間多重比較，空氣對照組、BMSC治療組接近(P=0.661)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BMSC治療組、PBS對照組比較有差異(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 60％吸入氧濃度是制作BPD小鼠模型的適宜濃度;由于肺通氣、換氣功能障礙，不能滿足新生小鼠新陳代謝需要，以及高濃度氧對細(xì)

28、胞的毒性作用，高氧暴露小鼠在發(fā)生BPD的過程中，出現(xiàn)慢性呼衰、氧依賴，體格生長緩慢，反應(yīng)差，活力下降的表現(xiàn)，證實(shí)我們的造模條件不僅能引起類似BPD的肺部損害，還能全面模擬人類BPD發(fā)病時(shí)的系統(tǒng)性表現(xiàn)。而肺部結(jié)構(gòu)的改變從第2天開始出現(xiàn)，并漸進(jìn)性發(fā)展為肺泡化受阻、纖維化形成及非正常結(jié)構(gòu)的破壞，因此，我們認(rèn)為，作為BPD治療的研究工具，持續(xù)給予60％濃度氧誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型符合研究要求。
　　 全骨髓貼壁培養(yǎng)方法成熟、易于操作，隨著

29、培養(yǎng)時(shí)間的延長及換液去除懸浮細(xì)胞，可有效分離出純化的BMSC，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)鑒定以及表面免疫標(biāo)記物的檢測，證實(shí)這種方法分離BMSC效果良好;原代細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，隨著純化程度的提高，BMSC生長速度加快，傳代后的細(xì)胞增殖較為迅速，3代BMSC誘導(dǎo)分化效率良好，適于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　 腹腔注射外源性BMSC，達(dá)到了向損傷肺組織的遷移，并可誘導(dǎo)SP-C表達(dá)，從而對損傷肺直接進(jìn)行修復(fù);BMSC抑制TGFβ1、膠原1α、TIMP-1等表達(dá)，繼