骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠百草枯中毒肺損傷的作用研究.pdf

1、研究背景
　　 百草枯(PQ)是目前廣泛使用的一種有機(jī)雜環(huán)類速效觸殺型除草劑，由于肺內(nèi)存在著胺類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而百草枯和二胺、多胺、及二硫胱胺具有結(jié)構(gòu)上的相似性，百草枯可與胺類物質(zhì)競爭通過肺泡Ⅱ型細(xì)胞的能量依賴性多胺攝取途徑而積聚在肺內(nèi)。因此，肺臟是百草枯中毒的主要靶器官(俗稱百草枯肺)。大量口服百草枯后會(huì)出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞受損，肺泡內(nèi)出血水腫，炎性細(xì)胞浸潤，死亡率極高。少量口服百草枯后，早期肺部癥狀比較輕微或

2、不明顯，隨著毒性作用時(shí)間加長，肺部損傷逐漸由炎性反應(yīng)過渡到不可逆的肺纖維化(此過程大約需要28天)，患者生存質(zhì)量嚴(yán)重下降，繼而進(jìn)行性呼吸困難，最后導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡。這種慢性肺纖維化是臨床百草枯中毒的常見死亡原因之一。因此，為改善生存狀況、降低死亡率，就要積極預(yù)防或者減輕肺纖維化的形成.雖然目前[1-4]對(duì)百草枯中毒有過很多機(jī)制及治療方面的研究與探索，且獲到一些成效，但都未取得突破性進(jìn)展，仍無有效解毒藥物，仍以激素、免疫抑制劑治療和對(duì)

3、癥支持治療為主，中毒者病死率高達(dá)50％-60％。所以，尋求PQ中毒引起肺損傷的新的治療策略，降低PQ中毒病死率具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目前醫(yī)學(xué)界研究和探討的重點(diǎn)是如何將干細(xì)胞成功應(yīng)用于各類臨床嚴(yán)重疾患的治療方面，為諸多患者帶來佳音。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)也稱骨髓基質(zhì)來源干細(xì)胞，是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞以外另一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞。在一定誘導(dǎo)條件下，這類細(xì)胞可定向分化為多

4、種造血以外的組織，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞[5]，例如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。因此，我們認(rèn)為MSCs移植有可能替代百草枯中毒肺部受損細(xì)胞，從而改善和恢復(fù)肺的通氣換氣，降低肺纖維化的形成。近年來已將MSCs引入到各種肺損傷的治療中，包括肺纖維化損傷，但研究多集中在MSCs的移植對(duì)博萊霉素、放射性骨髓抑制以及LPS誘導(dǎo)的肺損傷的動(dòng)物疾病模型的治療作用方面，而關(guān)于MSC移植對(duì)PQ中毒所致肺損

5、傷的研究還沒有報(bào)道。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)大鼠百草枯(PQ)中毒肺損傷的療效及可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
　　 1.分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓MSC
　　 取SPF級(jí)wistar大鼠100-130g，雌雄不拘，全骨髓貼壁分離法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，至第四代鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)統(tǒng)一，呈一致的梭形或長條形。取四代MSCs分別行流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型檢測

6、及成骨、成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示四代MSCs均表達(dá)CD90，不表達(dá)CD45和CD34，即CD34-/CD45-/CD90+，且在一定誘導(dǎo)條件下，成功向成骨、成脂肪誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。這就說明我們用的全骨髓貼壁分離篩選法可以獲得足夠量、生長旺盛、高純度、具有多向分化潛能的大鼠骨髓見充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在百草枯中毒大鼠肺組織中的植入
　　 60只SPF級(jí)Wistar大鼠，體重200g左右，

7、雌雄不拘，隨機(jī)分為4組，每組15只：A組，正常對(duì)照組；B組，肺損傷模型組(PQ+PBS)，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的百草枯18mg/kg，4h后經(jīng)尾靜脈注射1mlPBS；C組，MSCs治療組(PQ+MSCs)，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的百草枯18mg/kg，4h后經(jīng)尾靜脈注射MSCs-EGFP，1×106/只(重懸于1mlPBS中)；D組，MSCs對(duì)照組(MSCs+PBS)，腹腔注射等量的PBS，4h后經(jīng)尾靜脈注射MSCs-EGFP，1

8、×106/只(重懸于1mlPBS中)。
　　 取第三代MSCs，加入攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體Ad5-EGFP，轉(zhuǎn)染成功后，在染毒后4h經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，分別在給予MSCs后1d、3d、7d隨機(jī)處死每組大鼠各5只，行肺組織病理切片，熒光倒置顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移。結(jié)果顯示細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后，生長狀況良好，形態(tài)相同，基本不受病毒影響。在大鼠肺組織中，熒光顯微鏡下可見MSCs治療組大鼠在給予MSCs后一天、三

9、天肺組織中有少量綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，分布散在，無明顯規(guī)律，而肺損傷組，MSCs對(duì)照組，及正常對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞。染毒后7天均未見到陽性細(xì)胞。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯致大鼠肺損傷的保護(hù)作用
　　 20只SPF級(jí)wistar大鼠，體重200g左右，雌雄不拘，按上述方法隨機(jī)分為4組，觀察各組大鼠的一般情況，染毒后28d處死各組大鼠取相應(yīng)標(biāo)本，檢測肺系數(shù)、肺勻漿中羥脯氨酸(HYP)的含量及血清轉(zhuǎn)化生長因

10、子-β1(TGF-β1)水平，同時(shí)行肺組織病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示MSCs治療組大鼠肺纖維化及實(shí)變程度較百草枯中毒模型組輕。與正常對(duì)照組比較，各組血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，肺系數(shù)、肺勻漿中經(jīng)脯氨酸(HYP)的含量均顯著升高(P<0.05)。MSCs治療組各組指標(biāo)含量均好于百草枯中毒肺損傷模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、全骨髓貼壁分離法可成功分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在

11、體外穩(wěn)定培養(yǎng)。
　　 2、攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的腺病毒Ad5-EGFP可以成功轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3、大鼠尾靜脈注入骨髓MSCs后，MSCs可以在體內(nèi)向百草枯中毒肺損傷肺組織中植入。
　　 4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化和定植受百草枯中毒所致微環(huán)境的影響和制約，肺損傷越重，植入越明顯，而移植而來的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞又可以反過來改變PQ中毒肺部微環(huán)境，通過拮抗轉(zhuǎn)化生長因子β，有效降低PQ中毒大鼠肺組織