雷帕霉素干預(yù)急性百草枯中毒大鼠肺損傷機(jī)制的研究.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)，是目前全球使用最廣的除草劑之一，我國是目前世界生產(chǎn)、使用百草枯最大的國家，自殺性口服和誤服是急性PQ中毒的主要原因。口服PQ中毒者的病死率高達(dá)70％～80％，成為致死性最高的農(nóng)藥中毒事件。PQ可經(jīng)胃腸道、皮膚和呼吸道吸收，藥物可隨血流分布到各個臟器;其中PQ經(jīng)由肺臟發(fā)達(dá)的多胺攝取系統(tǒng)，肺內(nèi)濃度是血漿濃度的10～90倍。最具特征的毒性作用是迅速發(fā)展的彌漫性肺損害，表現(xiàn)為早期的急性肺損傷(acute lun

2、ginjury, ALI)，癥狀并進(jìn)行性發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)。如能度過一周的急性期，之后肺部損傷逐漸加重，不可逆發(fā)展為肺纖維化，后期多死于呼吸衰竭。雖然各國學(xué)者對此作了廣泛深入的研究，但至今仍未完全明了PQ中毒機(jī)制，亦無有效拮抗藥物。過去治療以減少毒物吸收、增加清除為主，效果不佳;目前治療主要以抗氧化、抗免疫反應(yīng)及綜合治療為主，但效果仍欠佳。百草枯中毒

3、治療目前處于探索階段，即使某些常規(guī)治療方法也存在爭議，國內(nèi)外學(xué)者正致力于尋找解毒劑。隨著各國學(xué)者對PQ的致病機(jī)制研究，對抗PQ中毒早期的ALI/ARDS與改善PQ中毒后期的肺纖維化成為目前PQ中毒治療的難點(diǎn)、熱點(diǎn)問題。
　　在PQ中毒引起的肺損傷過程中有多種促炎及纖維化細(xì)胞因子參與，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激

4、酶家族(phosphoinositide kinase-relatedkinase，PIKK)，位于PI3K/PKB(protein kinaseB，PKB)信號通路下游的一個效應(yīng)蛋白。mTOR是細(xì)胞內(nèi)多種重要信號傳導(dǎo)通路的樞紐，控制著多條調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控翻譯起始、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和降解功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞重要生理功能。mTOR還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程控制細(xì)胞增生。p70S6K和4E-BP1為mTOR的

5、兩個經(jīng)典底物，與蛋白合成有關(guān)。雷帕霉素是mTOR信號通路的特異性抑制劑，具有免疫抑制，抗炎、抗增殖作用。由于mTOR在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和存活中的重要地位，mTOR可能成為肺損傷治療中的一個新靶點(diǎn)。
　　本研究通過百草枯灌胃染毒建立急性百草枯中毒肺損傷模型，給予雷帕霉素作為干預(yù)措施，觀察百草枯中毒后肺損傷的大鼠病理、病理生理改變及氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子表達(dá)的變化及mTOR/p70S6K信號通路在百草枯中毒肺損傷的過程中的變化規(guī)律，進(jìn)

6、一步明確百草枯中毒肺損傷的機(jī)制，為臨床應(yīng)用雷帕霉素治療百草枯中毒提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、動物模型制備及分組
　　108只大鼠隨機(jī)分成三組:A組:對照組，B組:pQ染毒組，C組:雷帕霉素治療組。每組分為1、3、7、14、21及28天6個亞組，每組6只。對照組，1ml生理鹽水(NS)一次性灌胃，2小時后給予1ml賦形劑腹腔注射。PQ染毒組，PQ按40mg/kg用NS稀釋到1ml一次性灌胃染毒，2小時后給予1ml

7、賦形劑腹腔注射。雷帕霉素組，PQ按40mg/kg用NS稀釋到1ml一次性灌胃染毒，2小時后給予雷帕霉素(2mg/kg)稀釋到1ml腹腔注射。
　　2、灌胃染毒
　　PQ以40mg/kg計算，用NS將PQ稀釋到1ml給大鼠一次性灌胃染毒。
　　3、血標(biāo)本收集及檢測
　　10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉、打開腹腔，腹主動脈采血6～8ml，分成2管，一管血行血?dú)夥治黾案文I功、心肌酶學(xué)檢測;另一管血用于

8、測定大鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-6、IL-10、TNF-α。
　　4、肺組織標(biāo)本采集
　　采血完畢后，開胸剪下整個肺臟，觀察肺大體改變，結(jié)扎右肺門，取右上肺，用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅(HE)、Masson染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)及SABC免疫組化觀察;迅速用刀片切成約1×1×1(mm)小塊，置入盛有1

9、0％戊二醛小瓶中固定，及時送至電鏡室行組織超微結(jié)構(gòu)檢查。取右肺中葉迅速液氮中并轉(zhuǎn)到-80℃冰箱凍存，用于檢測羥脯氨酸(HYP)含量、免疫印跡法(Western blot)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測。取右下肺，用濾紙吸去右肺下葉血，稱濕重后，置烤箱中(80℃，72h)烤至恒重，稱干重，計算肺W/D比值。左肺行支氣管肺泡灌洗，收集到的支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存待測BALF中的蛋白含量。
　　5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用

10、國際統(tǒng)計軟件SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn);多樣本比較用單因素方差分析，如果差異具有顯著性，則進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠中毒表現(xiàn)及體重變化
　　對照組大鼠無中毒表現(xiàn)。染毒組大鼠在染毒后1～3天即可出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)為呼吸急促、張口呼吸、口周紫紺，染毒7天以后大鼠中毒癥狀逐漸好轉(zhuǎn);染毒后3天體重明顯下降，7天后體重開始增。雷帕霉素組，中毒癥狀、體征

11、較染毒組減輕，尤其是呼吸困難明顯減輕;大鼠的體重下降也不明顯。
　　2、大鼠動脈血?dú)庠趯?shí)驗(yàn)中的變化
　　染毒組動脈血二氧化碳(PaCO2)及氧分壓(PaO2)1～28天有下降趨勢，14～28天動脈血PaCO2、PaO2下降明顯，與對照組及治療組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。染毒組大鼠實(shí)驗(yàn)后1～7天pH值略升高，14～28天動脈血pH值下降，酸中毒加重，與對照組及治療組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。染毒組大鼠實(shí)驗(yàn)后1～28天乳酸值逐漸升高，但與對照組

12、及治療組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、各組大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)的變化
　　染毒組大鼠在染毒后1天血清CK-MB急劇上升，第3天最高，7天之后逐漸下降，21天接近對照組水平。與對照組比較，1、3、7及14天CK-MB明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。雷帕霉素治療組1、3、7及14天時肌酸激酶同工酶較染毒組明顯降低(P，＜0.05)，高于對照組(P＜0.01）。
　　4、各組大鼠肺組織濕干比（W/D）的

13、改變
　　大鼠在染毒后1天W/D急劇上升，第3天最高，7天之后逐漸下降，14天接近對照組水平。與對照組比較，1、3及7天W/D含量明顯升高(P＜0.01)。雷帕霉素組1、3及7天時W/D較染毒組明顯降低(P＜0.05)，高于對照組(P＜0.01)。
　　5、肺組織病理改變
　　對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常。染毒組1～7天出現(xiàn)明顯肺泡炎改變;7天以后炎癥細(xì)胞浸潤為主的肺泡炎，并伴有水腫和輕度出血;14～21天炎性改變減輕，成纖維細(xì)

14、胞增生，肺間隔明顯增寬、組織增生明顯;28天病變范圍彌散，出現(xiàn)明顯的肺纖維化。雷帕霉素組，1～7天大鼠急性肺泡炎減輕，后期肺纖維化明顯減輕。
　　6、血清中MDA、GSH-Px、 SOD、IL-6、IL-10及TNF-α水平的變化
　　(1)血清中丙二醛(MDA)水平的變化染毒組大鼠在染毒后1天血清MDA含量急劇上升，第3天時最峰，7天之后逐漸下降，14天接近對照組水平。與對照組比較，1、3及7天MDA含量明顯升高(P＜0.

15、01)。雷帕霉素組，1、3及7天時MDA較染毒組明顯降低(P＜0.05)，高于對照組(P＜0.01）。
　　(2)血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平的變化染毒組大鼠在染毒后1～7天血清GSH-Px活性逐漸下降，14天最低，21天后呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，28天接近對照組的活性。與對照組比較，1～14天GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。雷帕霉素組，血清GSH-Px活力明顯增加，1～14天活力較染毒組高(P＜0.05)，

16、但低于對照組（P＜0.01）。
　　(3)血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平的變化染毒組大鼠在染毒后1天血清SOD活性急劇下降，第3天最低、7天逐漸上升但仍低于對照組，14天上升至對照組的水平。與對照組比較，1、3及7天活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。雷帕霉素組，SOD活力明顯增加，1、3及7天時SOD活力較染毒組明顯升高(P＜0.05)，但低于對照組（P＜0.01）。
　　(4)血清中IL-6、IL-10及

17、TNF-α水平的變化染毒組大鼠在染毒后1天IL-6、TNF-α及IL-10含量急劇升高，第3天最高，7天后水平略有下降，14天時接近對照組水平。與對照組比較，1、3及7天含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。雷帕霉素組1、3及7天IL-6、TNF-α及IL-10含量較染毒組明顯降低(P＜0.05)，高于對照組（P＜0.01）。
　　7、大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白水平變化
　　染毒組大鼠在染毒后1天血清肺

18、泡灌洗液中蛋白含量急劇上升，第7天最高峰，之后逐漸下降，14天接近對照組水平。與對照組比較，1、3及7天肺泡灌洗液中蛋白含量明顯升高(P＜0.01)。雷帕霉素組1、3及7天肺泡灌洗液中蛋白含量較染毒組明顯降低(P＜0.05），但高于對照組(P＜0.01)。
　　8、Ashcrof評分判定肺組織纖維化
　　染毒組大鼠染毒后肺組織Ashcrof評分14天迅速升高，之后肺組織Ashcrof評分逐漸升高。與對照組比較，染毒組肺組織A

19、shcrof評分14、21及28天明顯升高(P＜0.01)。雷帕霉素治療組，14天及以后Ashcrof評分明顯高于對照組(P＜0.01)，但仍低于同時間點(diǎn)染毒組(P＜0.05)。
　　9、肺組織羥脯氨酸(HYP)含量的變化
　　染毒組大鼠染毒后肺組織HYP含量14天迅速升高，之后肺組織HYP含量逐漸升高。與對照組比較，染毒組肺組織HYP含量14、21及28天明顯升高(P＜0.01)。雷帕霉素組，14天及以后HYP含量明顯高于

20、對照組(P＜0.01)，但仍低于同時間點(diǎn)染毒組(P＜0.05）。
　　10、大鼠肺組織mTOR、p70S6K、TGF-β1、a-SMA、MMP-2及TIMP-1免疫組織化學(xué)及Western blot表達(dá)檢測結(jié)果
　　(1)大鼠肺組織mTOR及p70S6K表達(dá)變化對照組:大鼠肺組織中即有少量mTOR、p70S6K表達(dá)。染毒組:染毒后3天肺組織中mTOR、p70S6K表達(dá)略增強(qiáng)，第14天時最高，以后維持在較高水平，至28天時仍明

21、顯高于對照組(P＜0.01)。雷帕霉素組:肺組織中mTOR、p70S6K表達(dá)明顯減弱，在3～28天，與染毒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組比較均高于對照組(P＜0.01)。
　　(2)大鼠肺組織MMP-2及TIMP-1表達(dá)的變化對照組:大鼠肺組織中僅有少量MMP-2及TIMP-1的表達(dá)。染毒組:大鼠肺組織中MMP-2的表達(dá)從1天就明顯增強(qiáng)，第14天時最高此后開始下降，直至染毒后21天仍明顯強(qiáng)于對照組(P＜0.01)，

22、28天以后與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。TIMP-1的表達(dá)從1天就明顯增強(qiáng)，第21天最高，以后持續(xù)維持較高水平，至28天仍明顯高于對照組(P＜0.01)。雷帕霉素組:肺組織中MMP-2明顯減弱，在1～21天，與染毒組比較(P＜0.05)，與對照組比較均高于對照組(P＜0.01)。肺組織中TIMP-1明顯減弱，在1～28天，與染毒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組比較均高于對照組（P＜0.01）。雷帕霉素干預(yù)后矯正MMP-2/TI

23、MP-1不平衡比例，特別在第14及21天。
　　(3)肺組織TGF-β1及a-SMA表達(dá)的變化對照組:大鼠肺組織中即有少量TGF-β1及a-SMA的表達(dá)。染毒組:染毒后7天肺組織中TGF-β1及a-SMA蛋白表達(dá)即明顯增強(qiáng)，第14天最高，以后維持在較高水平，至28天仍明顯高于對照組(P＜0.01)。雷帕霉素組:肺組織中TGF-β1及a-SMA蛋白明顯減弱，在7～28天，與染毒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組比較均高于

24、對照組(P＜0.01)。
　　11、肺組織mTOR、p70S6K、CollagenⅠ及TGF-β1mRNA的變化
　　(1)肺組織mTOR及p70S6K mRNA的變化對照組:大鼠肺組織中即有少量mTOR及p70S6K mRNA表達(dá)。染毒組:染毒后3天肺組織中mTOR及p70S6KmRNA表達(dá)略增強(qiáng)，第14天最高，至28天時仍明顯高于對照組(P＜0.01)。雷帕霉素組:肺組織中mTOR及p70S6K mRNA明顯減弱，在3～

25、28天，與染毒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），與對照組比較均高于對照組(P＜0.01)。
　　(2)肺組織TGF-β1及CollagenⅠ mRNA的變化對照組:大鼠肺組織中即有少量TGF-β1、 CollagenⅠ mRNA表達(dá)。染毒組:大鼠肺組織中TGF-β1、 CollagenⅠmRNA表達(dá)從7天就明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，第14天最高，至28天時仍明顯高于對照組(P＜0.01)。雷帕霉素組:肺組織中TGF-β1、 C

26、ollagenⅠ mRNA明顯減弱，在7～28天，與染毒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與對照組比較高于對照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、百草枯中毒引起的肺損傷主要表現(xiàn)為1～7天的急性肺泡炎和14天以后逐漸進(jìn)展的肺間質(zhì)纖維化。血中百草枯濃度高峰比出現(xiàn)明顯中毒癥狀時間要早，因此要早期檢測血中百草枯濃度。
　　2、百草枯中毒大鼠體內(nèi)MDA含量升高、SOD及GSH-Px活力下降，說明PQ可引起過氧化損傷及肺

27、內(nèi)氧化一抗氧化系統(tǒng)失衡，進(jìn)而產(chǎn)生肺內(nèi)炎性反應(yīng)是造成急性肺損傷的主要機(jī)制之一。
　　3、促炎和抗炎細(xì)胞因子在百草枯中毒肺損傷中起關(guān)鍵作用，促炎細(xì)胞因子過度表達(dá)和抗炎細(xì)胞因子相對不足導(dǎo)致失控的炎性反應(yīng)與ALI發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TNF-α與IL-10的比值可影響ALI炎癥的程度和走向，因此改善體內(nèi)促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡，可能成為治療百草枯中毒肺損傷的重要手段。
　　4、百草枯中毒致急性肺損傷后，肺內(nèi)MMP-2及TIMP-1的表達(dá)不

28、同步造成ECM合成和降解不平衡，從而誘導(dǎo)肺纖維化形成。
　　5、氧化應(yīng)激作為主要的誘導(dǎo)因素之一，引起mTOR/p70S6K信號通路活化。它作為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的樞紐環(huán)節(jié)，活化后引起細(xì)胞因子調(diào)控失衡，mTOR、p70S6K、TNF-α及IL-6在中毒早期表達(dá)就增強(qiáng)，可能在肺泡炎階段起重要作用;而mTOR、p70S6K、α-SMA、TGF-β1及CollagenⅠ在中毒后期仍維持高水平，與TIMPs的變化一致，可能在纖維化形成過程中發(fā)

29、揮更為關(guān)鍵的作用，提示mTOR/p70S6K信號通路在百草枯肺損傷的過程中發(fā)揮雙重的調(diào)控作用。
　　6、本研究提出mTOR信號通路參與百草枯中毒致肺損傷的過程，并驗(yàn)證雷帕霉素可抑制mTOR活性，從而阻斷了mTOR/p70S6K信號通路，可調(diào)控肺內(nèi)氧化一抗氧化系統(tǒng)失衡，改善體內(nèi)促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡，調(diào)控膠原蛋白的合成與穩(wěn)定，調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs之間的平衡，并與TGF-β信號通路相互作用，影響細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生來減輕百草枯中毒致肺