Tollip過表達對百草枯中毒所致急性肺損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　百草枯(paraquat,PQ)中毒所致急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是PQ中毒死亡的主要原因，主要表現為急性肺泡炎和肺間質纖維化。由于中毒機制目前尚未闡明，而且沒有特效的治療手段，絕大多數病例死亡。因此，研究PQ中毒機制及其治療手段，具有非常重要的科學意義和社會應用前景。
　　一些動物實驗的研究結果得到的公認結論是氧化應激和炎癥反應起著重要的作用。由于Toll樣受體（Toll-lik

2、e receptors，TLRs）位于炎癥信號轉導的最上游環(huán)節(jié)，因而被認為是進行炎癥反應調控治療的潛在理想靶點。TLRs近年來在機體對外來病原體的識別和啟動天然防御系統方面的研究有很重要的進展，在調節(jié)ALI后的炎癥和修復機制方面扮演著重要的角色，而越來越多的證據表明TLRs在非感染性肺疾病中也扮演重要的角色。在動物模型中，大量的數據說明，TLR2和4對于非感染性刺激而促發(fā)炎癥反應。
　　Toll作用蛋白(Toll-interact

3、ing protein，Tollip)是新近發(fā)現的一種接頭蛋白，是TLRs/IL-1R信號轉導通路中的一個重要的負性調控因子，而該通路與炎癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關，它可以抑制IRAK的磷酸化，從而阻止下游信號轉導，減少NF-κB的轉錄活性，在炎癥反應的負調控中發(fā)揮重要作用。大量研究結果已證實Tollip過表達可以抑制TLR2和TLR4的信號轉導通路，限制促炎介質的生成，從而起到抑制炎癥反應的作用。因此，上調Tollip表達在治療急性炎癥性

4、疾病中可能是一種有效的治療策略。
　　本研究擬通過構建攜帶小鼠源性Tollip基因重組腺病毒載體上調Tollip的表達。通過觀察A549細胞在基因表達、氧化應激和炎癥反應等方面的變化，研究Tollip過表達對百草枯誘導的A549細胞功能的影響;并在動物水平上，確定Tollip對PQ中毒所致小鼠ALI的保護作用，為PQ所致ALI的防治提供新的作用靶點。
　　實驗方法：
　　1、小鼠Tollip基因重組腺病毒載體的表達與驗

5、證
　　通過Ad.mTollip感染A549細胞和小鼠肺組織，建立Ad.mTollip體內外的感染模型，利用Western-blot、免疫組化和肺組織切片HE染色的方法，對Ad.mTollip在真核細胞與肺內的表達效力及對宿主肺部病理改變的影響進行檢測。
　　2、Tollip過表達對百草枯誘導的A549細胞功能的影響及機制研究
　　通過CCK-8法檢測細胞存活率篩選出PQ濃度及作用時間，以MOI=100分別加入Ad.m

6、Tollip或Ad.V感染A549細胞，48h后以PQ600μmol/L處理細胞，作用時間點為24h，分四組:control組、PQ組、PQ+Ad.V組、PQ+Ad.mTollip組。用免疫細胞化學染色、RT-PCR和Western-blot的方法觀察TLR2、TLR4和Tollip在A549細胞中的表達情況;用流式細胞儀檢測細胞內活性氧含量;檢測超氧化物歧化酶的活性和丙二醛的含量;用EMSA檢測A549細胞中NF-κB核轉錄水平的變化

7、;用ELISA檢測細胞上清液IL-1β水平變化。
　　3、Tollip過表達對百草枯中毒所致小鼠急性肺損傷的保護作用
　　選擇清潔級C57BL/6J小鼠42只，8-12周齡，體重20-25 g，雌雄不限，隨機分為七組:control、PQ24h組、PQ72h組、PQ+Ad.V24h組、PQ+Ad.V72h組、PQ+Ad.mTollip24h組、PQ+Ad.mTollip72h組，每組6只小鼠。用氣管內滴注的方法，以5×108

8、PFU/只的劑量建立小鼠Ad.mTollip感染模型，同時空病毒載體Ad.V作為對照。感染48h后，腹腔注射PQ28 mg/kg建立急性肺損傷模型。在PQ染毒后24h、72h，用免疫組織化學染色、RT-PCR和Western-blot的方法觀察Tollip在小鼠肺內的表達情況;HE染色觀察小鼠肺組織病理學變化并進行病理學評分;檢測髓過氧化物酶的活力;用EMSA檢測肺內NF-κB核轉錄水平的變化;用ELISA檢測血清和肺組織勻漿中IL-1

9、β水平變化。
　　實驗結果：
　　1、通過Western-blot和免疫組化方法分別檢測到重組腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549細胞內和小鼠肺內穩(wěn)定表達;且經氣管內滴注感染宿主后，不會引起宿主肺組織發(fā)生病理變化。
　　2、通過CCK-8法確定PQ600μmol/L作用24h作為實驗的干預點;通過免疫細胞化學、Real-time PCR和Western-blot方法觀察在PQ誘導后，TLR2和TLR4在mRN

10、A水平和蛋白水平都有顯著升高(P＜0.05)，而Tollip在mRNA水平和蛋白水平都有所下降，轉染Ad.mTollip后，TLR2和4表達明顯下調(P＜0.05)，而Tollip的表達明顯上調(P＜0.05);與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組ROS水平和MDA含量均明顯降低，而SOD水平均明顯升高(P＜0.05);細胞內NF-κB活性明顯降低，炎癥因子IL-1β的生成隨之明顯降低(P＜0.05)。
　

11、　3、免疫組化、RT-PCR以及Western-blot的方法觀察Tollip在PQ組和PQ+Ad.V組表達減弱，表達強度低于正常對照組，而與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組的Tollip表達強度明顯增強(P＜0.05);轉染Ad.mTollip后，與PQ組和PQ+Ad.V組相比，PQ+Ad.mTollip組小鼠肺組織的損傷減輕、肺內MPO和NF-κB的活性降低、血清和肺組織勻漿中炎癥介質IL-1β的含量減少。

12、
　　結論：
　　1、重組腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549細胞內和小鼠肺內穩(wěn)定表達，同時對于宿主而言也是安全可行的。
　　2、TLR2和TLR4可能參與了PQ導致A549細胞內氧化應激和炎癥反應。
　　3、轉染Ad.mTollip后，Tollip過表達，細胞內ROS水平和MDA含量均明顯降低，而SOD水平明顯升高，抑制PQ導致A549細胞內氧化應激反應的發(fā)生。
　　4、PQ導致的炎癥反應可能是