DHA對百草枯誘導(dǎo)肺損傷的拮抗作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 百草枯(paraquat，PQ)，又名對草快、克蕪蹤等，由于其除草效果好，對環(huán)境污染小，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。隨著百草枯的廣泛使用，近年來由百草枯引起的中毒病例不斷增多。百草枯對人的毒性極大，肺組織是其作用的主要靶器官，目前臨床上尚無特效藥物治療，中毒死亡率可達(dá)50-90％。雖然近年來對百草枯的中毒機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但目前尚未完全闡明。因而研究百草枯致機(jī)體損傷的機(jī)制，對于有效的預(yù)防和治療百草枯中毒具有重要的現(xiàn)實(shí)意

2、義。
　　 二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)是n-3系列多不飽和脂肪酸（n-3polyunsaturatedfattyacids，n-3PUFA），主要是從魚油或者微藻油中提煉的。早期的研究表明，DHA對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要作用，并對心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化等起到較好的治療效果。新近的研究顯示，DHA具有明顯的抗炎抗氧化作用，并在一定程度上減輕人類的一些纖維病變。早期的急性炎癥和后期的肺纖

3、維化是百草枯中毒死亡的主要原因，因此我們推測DHA可能具有拮抗百草枯誘導(dǎo)的肺損傷的作用。
　　 為研究DHA對百草枯中毒的拮抗作用，本研究采用一次性經(jīng)口給予雄性昆明小鼠50mg/kg.bwPQ建立急性肺損傷模型，從動物死亡情況、氧化抗氧化系統(tǒng)等方面觀察DHA拮抗百草枯引起的急性肺損傷的作用;采用一次性經(jīng)口給予雄性wistar大鼠50mg/kg.bwPQ染毒，建立百草枯肺纖維化模型，通過測定肺組織中膠原纖維蛋白含量及肺組織病理改變

4、，觀察DHA對百草枯引起的肺纖維化的拮抗作用，通過檢測肺組織纖維化過程中的兩個重要調(diào)控因子Smad7、SnoN的蛋白水平的變化初步探討百草枯引起肺纖維化的中毒機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.急性肺損傷模型的建立及指標(biāo)測定
　　 SPF級雄性昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組和DHA干預(yù)組，每組24只。DHA干預(yù)組動物每天經(jīng)灌胃給予500mg/kg.bw的DHA;正常對照組、模型組動物每天給

5、予等體積的玉米油灌胃。在給予DHA的第8天，PQ經(jīng)生理鹽水稀釋后，模型組和DHA干預(yù)組動物經(jīng)灌胃一次性給予50mg/kg.bwPQ染毒，正常對照組給予等體積生理鹽水。PQ染毒后，持續(xù)給予DHA，觀察記錄各組動物死亡情況，于染毒7天后20％烏拉坦腹腔注射麻醉動物，取肺組織進(jìn)行各指標(biāo)測定。
　　 觀察PQ染毒后各組小鼠的死亡情況，比較各組小鼠的肺臟系數(shù)，采用生化法測定小鼠肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、

6、還原性谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;Westernblotting測定小鼠肺組織中4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE）和MDA蛋白加合物水平的變化。
　　 2.肺纖維化模型的建立及指標(biāo)測定
　　 SPF級雄性Wistar大鼠，體重200～220g，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、DHA干預(yù)組和DHA對照

7、組，每組10只。DHA干預(yù)組和DHA對照組每天一次分別給予500mg/kw.bw的DHA灌胃，正常對照組、模型組給予等體積玉米油。給予DHA的第8天，PQ用生理鹽水稀釋后，經(jīng)灌胃分別給予模型組、DHA干預(yù)組動物50mg/kg.bw的PQ一次性染毒，等體積生理鹽水分別給予正常對照組和DHA對照組。PQ染毒后，各組動物持續(xù)給予DHA，于染毒后第35天，處死動物。
　　 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察肺組織病理學(xué)改變，Masson染色

8、法、濕重/干重比值(wet-to-dryweightratio，W/D)觀察肺組織纖維化程度;肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量采用堿水解法測定;采用SABC免疫組織化學(xué)法、Westernblotting測定大鼠肺組織中Smad7、SnoN蛋白水平的變化。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.DHA對百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷的拮抗作用
　　 1.1DHA對PQ誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷致死亡的影響
　

9、　 模型組和DHA干預(yù)組經(jīng)灌胃一次性給予PQ7天后，模型組小鼠死亡率為58.3％，DHA干預(yù)組小鼠死亡率為33.3％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明DHA能顯著降低PQ誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷導(dǎo)致的死亡。
　　 1.2DHA對PQ誘導(dǎo)小鼠肺臟器系數(shù)的影響
　　 PQ染毒7天后，肉眼解剖觀察，正常對照組小鼠肺組織呈粉紅色，無充血、水腫現(xiàn)象;模型組動物肺組織表面色澤暗紅，充血、水腫明顯，體積明顯增大，包膜下可見點(diǎn)狀、片狀

10、出血，切面疏松，有淡紅色液體溢出;DHA干預(yù)組動物肺組織較模型組動物損傷明顯減輕，輕度充血、水腫，有散在包膜下出血。正常對照組肺臟器系數(shù)為（0.574±0.085）％，PQ誘導(dǎo)肺損傷后，模型組的肺臟器系數(shù)為（1.021±0.683）％，DHA干預(yù)組為（0.710±0.20）％，與正常對照組相比，模型組肺臟器系數(shù)增加了77.87％(P＜0.01);提前1周給予DHA干預(yù)，可明顯降低PQ誘導(dǎo)的肺充血水腫和炎性變化，與模型組相比，兩者差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 1.3DHA對PQ誘導(dǎo)急性肺損傷肺組織中MPO、MDA及GSH含量的影響
　　 與正常對照組相比，模型組動物肺組織中的MPO含量增加了20.6％(P＜0.01);DHA干預(yù)組肺組織中的MPO含量明顯低于模型組(P＜0.05)，與正常對照組無明顯差別。
　　 模型組小鼠給予PQ后肺組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯增強(qiáng)。與正常對照組相比，模型組肺組織中MDA含量增加了21.7％(P＜0.01

12、);DHA干預(yù)組比模型組減少了14.4％（P＜0.01），說明提前給予7天DHA能夠有效抑制肺組織中MDA水平的增加(P＜0.01)。
　　 PQ攝入7天后，與正常對照組相比，模型組動物肺組織中GSH水平下降了14.2％(P＜0.01)，與模型組相比，DHA干預(yù)組GSH水平顯著增加（P＜0.05），與正常對照組差別不明顯(P＞0.05)。
　　 1.4DHA對PQ誘導(dǎo)急性肺損傷肺組織中4-HNE、MDA蛋白加合物水平的影

13、響
　　 Westernblotting的結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織中4-HNE蛋白加合物表達(dá)水平增加了43.97％(P＜0.05)，而提前給予DHA干預(yù)后，小鼠肺組織中的4-HNE蛋白加合物表達(dá)水平僅增加了3.16％，比模型組顯著減少(P＜0.05);與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織中MDA蛋白加合物表達(dá)水平增加了42.39％(P＜0.05)，提前給予DHA干預(yù)后，小鼠肺組織中的MDA蛋白加合物表達(dá)水平增加

14、了16.97％，DHA對照組與正常對照組均無明顯差別(P＞0.05)。說明提前給予DHA干預(yù)能夠有效降低PQ引起的肺組織的氧化應(yīng)激。
　　 2.DHA對百草枯引起的肺纖維化的拮抗作用
　　 2.1動物體重及一般情況觀察
　　 模型組動物給予PQ染毒后，皮毛蓬松，毛色暗淡，精神萎靡，進(jìn)食、進(jìn)水量減少，行動遲緩。染毒后體重增長減慢，28天后體重明顯低于正常對照組(P＜0.05)，DHA干預(yù)組、DHA對照組體重與正常對

15、照組無明顯差別。
　　 2.2肺組織HE染色
　　 各組動物肺組織經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察可見，正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，壁薄，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤;模型組肺組織間隔增厚變寬，肺泡腔明顯狹窄，伴局灶性肺不張;DHA干預(yù)組動物肺泡壁無明顯增厚，結(jié)構(gòu)清晰，病變不明顯;DHA對照組與正常對照組無明顯差別。
　　 2.3肺組織纖維化改變
　　 2.3.1W/D比值
　　 PQ模型組的W/D明顯小于正常對照

16、組(P＜0.05)，與模型組相比，DHA干預(yù)組與DHA對照組W/D均顯著增大（P＜0.05），與正常對照組無顯著差別。
　　 2.3.2肺組織中羥脯氨酸含量
　　 PQ染毒35天后，與正常對照組相比，模型組肺組織中的羥脯氨酸含量增加了18.3％(P＜0.05);DHA干預(yù)組及DHA對照組的含量與正常對照組差別不明顯，但明顯低于模型組(P＜0.05)。
　　 2.3.3Masson染色
　　 各組肺組織經(jīng)M

17、asson染色后，光鏡下觀察可見，正常對照組動物肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁周圍有少量藍(lán)色膠原纖維，腔內(nèi)無膠原蛋白沉積;模型組動物肺泡壁增厚明顯，大量膠原蛋白沉積與肺泡壁及肺泡腔內(nèi)，肺泡腔狹窄變形，部分肺泡出現(xiàn)實(shí)變現(xiàn)象;DHA干預(yù)組動物肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁周圍及肺泡腔中無明顯膠原蛋白沉積，無實(shí)變現(xiàn)象;DHA對照組與正常對照組差別不明顯。
　　 2.4肺組織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá)
　　 2.4.1免疫組織化學(xué)方法測定肺組

18、織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá)
　　 鏡下觀察可見，Smad7表達(dá)于肺泡和上皮細(xì)胞中。正常對照組Smad7陽性著色面積大且密集，模型組陽性著色面積比正常對照組明顯減少，并且比較分散，DHA干預(yù)組的陽性著色面積較模型組增加，DHA對照組與對照組差別不明顯;積分光密度結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組積分光密度降低了63％（P＜0.01），與模型組相比，DHA干預(yù)組積分光密度比模型組增加了112.7％(P＜0.01)，DHA對照組

19、與正常對照組差別不明顯(P＞0.05)。
　　 SnoN蛋白主要在肺泡中表達(dá)，正常對照組SnoN蛋白陽性著色面積密集，分布均勻，與正常對照組比較，模型組陽性著色面積明顯減少，且分布不均勻，DHA干預(yù)組的陽性著色面積分布均勻，較模型組增加;與正常對照組相比，模型組積分光密度降低了41％(P＜0.01)，與模型組比較，DHA干預(yù)組的積分光密度比模型組增加了42.4％（P＜0.01），DHA對照組與正常對照組無明顯差別(P＞0.05)

20、。
　　 2.4.2Westernblotting測定肺組織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá)
　　 Westernblotting的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中Smad7及SnoN蛋白表達(dá)均顯著減少(P＜0.05，P＜0.01);而提前給予DHA干預(yù)后，大鼠肺組織中的Smad7與SnoN蛋白表達(dá)均未明顯減少，與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），說明DHA能夠有效抑制百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺組織

21、Smad7和SnoN表達(dá)的降低;DHA對照組與正常對照組差別不大（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.DHA(500mg/kg.bw)可有效拮抗50mg/kg.bwPQ所致小鼠急性肺損傷。
　　 2.DHA可顯著降低PQ誘導(dǎo)的肺臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4-HNE、MDA蛋白加合物的產(chǎn)生，DHA可能通過其抗氧化活性，降低肺臟氧化應(yīng)激拮抗PQ致急性肺損傷。
　　 3.DHA（500mg/kg.bw）可有效拮抗5