人臍帶間充質(zhì)干細胞治療內(nèi)毒素誘導大鼠急性肺損傷的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)在膿毒癥等危重病人中的發(fā)病率和死亡率極高，目前，對ALI的研究主要集中在ALI相關炎癥細胞、細胞因子、黏附因子的相互作用、表達調(diào)控等方面，雖然取得了一定的成果，但其發(fā)病機制仍未闡明。ALI的治療主要是支持性治療，尚未找到特效治療措施，死亡率高達40

2、％，亟需探索新的治療方法，因而成為醫(yī)學研究人員亟待突破的重大醫(yī)學難題之一。最新研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)具有多向分化、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌特性，不僅能夠歸巢至損傷組織、在受損組織中抑制免疫反應及炎性反應，還具有向多種組織細胞分化的潛能，在創(chuàng)傷修復、組織功能再生與重建、免疫調(diào)節(jié)與治療等研究領域應用前景廣闊。多個動物實驗研究表明，BM-MSCs可通過抗炎、抗

3、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等作用，減輕內(nèi)毒素引起的急性肺損傷，改善肺功能，提高生存率，為急性肺損傷治療提供了新的方法與思路。
　　 然而，作為MSCs經(jīng)典來源的骨髓組織隨著年齡增長存在干細胞含量和增殖能力降低、操作過程易造成感染等問題，尋找理想來源的間充質(zhì)干細胞十分必要。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在幾乎所有組織和器官中均可提取，其在免疫調(diào)節(jié)及低免疫源性方面的優(yōu)點與其來源無關。與BM-MSCs相比，

4、臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)具有獲取方便、易提取、細胞量大、增殖率高、更安全等優(yōu)點，目前尚無UC-MSCs治療內(nèi)毒素肺損傷的報道。本研究擬首先比較BM-MSCs和UC-MSCs的細胞形態(tài)、細胞表型、分化能力和免疫能力，并采用全基因組表達芯片比較二者的功能基因表達情況，然后通過注射內(nèi)毒素制備大鼠肺損傷模型，驗證人UC-MSCs輸注能否通過抑制炎癥反應、抑制氧

5、化應激等減輕內(nèi)毒素致肺損傷，并提高生存率。
　　 方法：
　　 1)間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和鑒定：原代培養(yǎng)人BM-MSCs和UC-MSCs，并通過形態(tài)學觀察和流式細胞術鑒定這兩種細胞的一般特征；使用β-甘油磷酸鈉、TGF-β和胰島素等化學誘導方法誘導兩種MSCs向成骨、軟骨和脂肪細胞方向誘導分化，利用茜素紅S、油紅O和甲苯胺藍染色等方法鑒定其多向分化功能；
　　 2)利用芯片分析MSCs的基因表達：分別提取BM-MS

6、Cs和UC-MSCs的RNA，通過人全基因組表達基因芯片對這兩種細胞的基因組表達和微小RNA表達情況進行比較分析，并對差異表達的基因進行GO功能聚類分析；
　　 3)膿毒癥急性肺損傷模型的制作：選擇SD大鼠60只，隨機分為四組：對照組、LPS組、Fibroblast+LPS組和MSC+LPS組即治療組，每組15只，按照10mg/kg體重腹腔內(nèi)注射LPS，制造膿毒癥急性肺損傷模型，并進行常規(guī)病理切片、支氣管肺泡灌洗液、肺濕干比和血

7、清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析。
　　 4)UC-MSCs輸注治療肺損傷：LPS注射致肺損傷1小時后，MSC+LPS組尾靜脈注射含5×105臍帶間充質(zhì)干細胞的生理鹽水300μl，F(xiàn)ibroblast+LPS組注射含5×105人成纖維細胞(MRC-5細胞系)的生理鹽水300μl，其余兩組注射等量生理鹽水。并分別于輸注治療后6小時、24小時和48小時每組處死3到5只大鼠，收集血漿、肺組織，進行常規(guī)病理切片

8、、支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞計數(shù)及蛋白定量、肺濕干比和血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析，并檢測肺組織氧化損傷指標MDA含量，以及HO-1酶的活性和蛋白Western Blotting定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1)我們所培養(yǎng)的骨髓和臍帶MSC均可旺盛增殖，呈現(xiàn)典型的成纖維狀細胞形態(tài)，表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166等典型的MSC細胞表面抗原，不表達CD31

9、、CD34和CD45等造血和內(nèi)皮細胞標志，在誘導后可向造骨、軟骨和脂肪細胞分化，并表達其特異性標志。
　　 2)通過基因芯片和生物信息學分析，與UC-MSCs相比，BM-MSCs表達更多的免疫反應相關基因，而UC-MSC更多的表達器官發(fā)育和生長等早期發(fā)育相關基因。KEGG信號通路分析同樣證明BM-MSCs高表達免疫相關信號通路。在UC-MSCs中的高表達的前3個miRNA分別是miR-519e*、miR-518a-5p和miR-

10、520d-5p。而BM-MSCs則高表達miR-373*、miR-492、miR-498和miR-409-5p，這些miRNA的靶基因均主要與腫瘤發(fā)生有關。
　　 3)腹腔注射LPS6小時后，肺組織病理表現(xiàn)為明顯的毛細血管擴張充血，中性粒細胞明顯增多，并于24小時達到高峰，同時出現(xiàn)肺泡間隔明顯增厚直至48小時仍不能有效緩解。腹腔注射LPS后24小時肺組織濕干比明顯升高，48小時逐漸恢復減輕。在中性粒細胞浸潤方面，LPS腹腔注射后

11、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞于24小時和48小時有明顯升高，而肺組織MPO活性也同時明顯升高。經(jīng)過LPS處理造模，LPS導致大鼠血漿中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6濃度明顯升高并于刺激6小時后達到高峰，于24小時和48小時逐漸下降。
　　 4)臍帶間充質(zhì)干細胞治療后肺組織表現(xiàn)出一定程度的肺損傷，但嚴重程度在三個時間點均較單純LPS損傷組明顯減輕。而人肺成纖維細胞治療不能改善LPS誘發(fā)的肺損傷病理改變。臍帶間充質(zhì)干細胞

12、治療后，24小時肺濕干比明顯改善。支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度是檢測肺毛細血管內(nèi)皮和肺泡上皮通透性的重要指標，LPS引起支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度迅速升高，并于24小時達到高峰，MSC+LPS組在各時間點灌洗液蛋白濃度雖均有降低，但未達到統(tǒng)計學差異。在中性粒細胞浸潤和肺組織MPO活性方面：MSC+LPS組與LPS組相比兩者均明顯下降。臍帶間充質(zhì)干細胞治療明顯降低了LPS誘發(fā)的全身炎癥反應，血漿中的促炎因子濃度TNF-α、IL-1β、IL-6在

13、治療后6小時即明顯下降，在此后的24和48小時均低于LPS損傷組。LPS同樣引起各時間段抗炎因子IL-10血漿濃度的明顯升高，臍帶間充質(zhì)干細胞治療沒有影響IL-10血漿濃度的升高。
　　 5)肺組織MDA水平是氧化損傷程度的標志，LPS腹腔注射后各時間點MDA均明顯升高，而MSC+LPS組與LPS組相比MDA各時間點均明顯下降。我們還檢測了損傷24小時各組HO-1的蛋白表達及活性水平，結(jié)果顯示對照組HO-1有輕微表達，而LPS注

14、射后肺組織HO-1表達明顯增強，臍帶間充質(zhì)干細胞治療后HO-1表達進一步增強。HO-1活性水平與此相似。
　　 6)在生存率方面，臍帶間充質(zhì)干細胞治療組48小時生存率明顯高于單純損傷組，分別為87％和60％，治療組大鼠生存率提高了20％，而人肺成纖維細胞對LPS誘導肺損傷生存率沒有改善作用。
　　 結(jié)論：
　　 1)骨髓和臍帶均可獲得MSC，符合國際上對MSC的界定標準，但UC-MSCs的增殖能力明顯高于BM-M

15、SCs，且同樣具有多向分化能力。BM-MSCs的免疫抑制能力雖然高于UC-MSCs，但不具有顯著性差異；
　　 2)靜脈注射臍帶間充質(zhì)干細胞明顯提高了內(nèi)毒素肺損傷模型大鼠的生存率。臍帶間充質(zhì)干細胞明顯降低了血中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，對IL-10無影響，減輕了內(nèi)毒素引起的全身炎癥反應。臍帶間充質(zhì)干細胞可通過減輕肺水腫、減少中性粒細胞肺部浸潤等明顯改善內(nèi)毒素肺損傷。促進抗炎與抑炎反應平衡、減輕氧化應激可能是臍