人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)及其嚴(yán)重形式急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)在膿毒癥等危重病人中的發(fā)病率和死亡率極高，目前，對(duì)ALI的研究主要集中在ALI相關(guān)炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、黏附因子的相互作用、表達(dá)調(diào)控等方面，雖然取得了一定的成果，但其發(fā)病機(jī)制仍未闡明。ALI的治療主要是支持性治療，尚未找到特效治療措施，死亡率高達(dá)40

2、％，亟需探索新的治療方法，因而成為醫(yī)學(xué)研究人員亟待突破的重大醫(yī)學(xué)難題之一。最新研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)具有多向分化、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌特性，不僅能夠歸巢至損傷組織、在受損組織中抑制免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)，還具有向多種組織細(xì)胞分化的潛能，在創(chuàng)傷修復(fù)、組織功能再生與重建、免疫調(diào)節(jié)與治療等研究領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，BM-MSCs可通過(guò)抗炎、抗

3、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等作用，減輕內(nèi)毒素引起的急性肺損傷，改善肺功能，提高生存率，為急性肺損傷治療提供了新的方法與思路。
　　 然而，作為MSCs經(jīng)典來(lái)源的骨髓組織隨著年齡增長(zhǎng)存在干細(xì)胞含量和增殖能力降低、操作過(guò)程易造成感染等問(wèn)題，尋找理想來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞十分必要。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在幾乎所有組織和器官中均可提取，其在免疫調(diào)節(jié)及低免疫源性方面的優(yōu)點(diǎn)與其來(lái)源無(wú)關(guān)。與BM-MSCs相比，

4、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)具有獲取方便、易提取、細(xì)胞量大、增殖率高、更安全等優(yōu)點(diǎn)，目前尚無(wú)UC-MSCs治療內(nèi)毒素肺損傷的報(bào)道。本研究擬首先比較BM-MSCs和UC-MSCs的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型、分化能力和免疫能力，并采用全基因組表達(dá)芯片比較二者的功能基因表達(dá)情況，然后通過(guò)注射內(nèi)毒素制備大鼠肺損傷模型，驗(yàn)證人UC-MSCs輸注能否通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧

5、化應(yīng)激等減輕內(nèi)毒素致肺損傷，并提高生存率。
　　 方法：
　　 1)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定：原代培養(yǎng)人BM-MSCs和UC-MSCs，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)鑒定這兩種細(xì)胞的一般特征；使用β-甘油磷酸鈉、TGF-β和胰島素等化學(xué)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)兩種MSCs向成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，利用茜素紅S、油紅O和甲苯胺藍(lán)染色等方法鑒定其多向分化功能；
　　 2)利用芯片分析MSCs的基因表達(dá)：分別提取BM-MS

6、Cs和UC-MSCs的RNA，通過(guò)人全基因組表達(dá)基因芯片對(duì)這兩種細(xì)胞的基因組表達(dá)和微小RNA表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，并對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能聚類分析；
　　 3)膿毒癥急性肺損傷模型的制作：選擇SD大鼠60只，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、LPS組、Fibroblast+LPS組和MSC+LPS組即治療組，每組15只，按照10mg/kg體重腹腔內(nèi)注射LPS，制造膿毒癥急性肺損傷模型，并進(jìn)行常規(guī)病理切片、支氣管肺泡灌洗液、肺濕干比和血

7、清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析。
　　 4)UC-MSCs輸注治療肺損傷：LPS注射致肺損傷1小時(shí)后，MSC+LPS組尾靜脈注射含5×105臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生理鹽水300μl，F(xiàn)ibroblast+LPS組注射含5×105人成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞系)的生理鹽水300μl，其余兩組注射等量生理鹽水。并分別于輸注治療后6小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)每組處死3到5只大鼠，收集血漿、肺組織，進(jìn)行常規(guī)病理切片

8、、支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白定量、肺濕干比和血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析，并檢測(cè)肺組織氧化損傷指標(biāo)MDA含量，以及HO-1酶的活性和蛋白Western Blotting定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1)我們所培養(yǎng)的骨髓和臍帶MSC均可旺盛增殖，呈現(xiàn)典型的成纖維狀細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166等典型的MSC細(xì)胞表面抗原，不表達(dá)CD31

9、、CD34和CD45等造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，在誘導(dǎo)后可向造骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化，并表達(dá)其特異性標(biāo)志。
　　 2)通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)分析，與UC-MSCs相比，BM-MSCs表達(dá)更多的免疫反應(yīng)相關(guān)基因，而UC-MSC更多的表達(dá)器官發(fā)育和生長(zhǎng)等早期發(fā)育相關(guān)基因。KEGG信號(hào)通路分析同樣證明BM-MSCs高表達(dá)免疫相關(guān)信號(hào)通路。在UC-MSCs中的高表達(dá)的前3個(gè)miRNA分別是miR-519e*、miR-518a-5p和miR-

10、520d-5p。而B(niǎo)M-MSCs則高表達(dá)miR-373*、miR-492、miR-498和miR-409-5p，這些miRNA的靶基因均主要與腫瘤發(fā)生有關(guān)。
　　 3)腹腔注射LPS6小時(shí)后，肺組織病理表現(xiàn)為明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，中性粒細(xì)胞明顯增多，并于24小時(shí)達(dá)到高峰，同時(shí)出現(xiàn)肺泡間隔明顯增厚直至48小時(shí)仍不能有效緩解。腹腔注射LPS后24小時(shí)肺組織濕干比明顯升高，48小時(shí)逐漸恢復(fù)減輕。在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)方面，LPS腹腔注射后

11、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞于24小時(shí)和48小時(shí)有明顯升高，而肺組織MPO活性也同時(shí)明顯升高。經(jīng)過(guò)LPS處理造模，LPS導(dǎo)致大鼠血漿中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6濃度明顯升高并于刺激6小時(shí)后達(dá)到高峰，于24小時(shí)和48小時(shí)逐漸下降。
　　 4)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療后肺組織表現(xiàn)出一定程度的肺損傷，但嚴(yán)重程度在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較單純LPS損傷組明顯減輕。而人肺成纖維細(xì)胞治療不能改善LPS誘發(fā)的肺損傷病理改變。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

12、治療后，24小時(shí)肺濕干比明顯改善。支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度是檢測(cè)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮通透性的重要指標(biāo)，LPS引起支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度迅速升高，并于24小時(shí)達(dá)到高峰，MSC+LPS組在各時(shí)間點(diǎn)灌洗液蛋白濃度雖均有降低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織MPO活性方面：MSC+LPS組與LPS組相比兩者均明顯下降。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療明顯降低了LPS誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，血漿中的促炎因子濃度TNF-α、IL-1β、IL-6在

13、治療后6小時(shí)即明顯下降，在此后的24和48小時(shí)均低于LPS損傷組。LPS同樣引起各時(shí)間段抗炎因子IL-10血漿濃度的明顯升高，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療沒(méi)有影響IL-10血漿濃度的升高。
　　 5)肺組織MDA水平是氧化損傷程度的標(biāo)志，LPS腹腔注射后各時(shí)間點(diǎn)MDA均明顯升高，而MSC+LPS組與LPS組相比MDA各時(shí)間點(diǎn)均明顯下降。我們還檢測(cè)了損傷24小時(shí)各組HO-1的蛋白表達(dá)及活性水平，結(jié)果顯示對(duì)照組HO-1有輕微表達(dá)，而LPS注

14、射后肺組織HO-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療后HO-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。HO-1活性水平與此相似。
　　 6)在生存率方面，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組48小時(shí)生存率明顯高于單純損傷組，分別為87％和60％，治療組大鼠生存率提高了20％，而人肺成纖維細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)肺損傷生存率沒(méi)有改善作用。
　　 結(jié)論：
　　 1)骨髓和臍帶均可獲得MSC，符合國(guó)際上對(duì)MSC的界定標(biāo)準(zhǔn)，但UC-MSCs的增殖能力明顯高于BM-M

15、SCs，且同樣具有多向分化能力。BM-MSCs的免疫抑制能力雖然高于UC-MSCs，但不具有顯著性差異；
　　 2)靜脈注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞明顯提高了內(nèi)毒素肺損傷模型大鼠的生存率。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞明顯降低了血中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，對(duì)IL-10無(wú)影響，減輕了內(nèi)毒素引起的全身炎癥反應(yīng)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)減輕肺水腫、減少中性粒細(xì)胞肺部浸潤(rùn)等明顯改善內(nèi)毒素肺損傷。促進(jìn)抗炎與抑炎反應(yīng)平衡、減輕氧化應(yīng)激可能是臍