骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 嚴(yán)重感染膿毒血癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷最重要和常見(jiàn)的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究旨在觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在脂多糖(LPS)誘發(fā)的大鼠急性肺損傷肺組織中的植入和分布，以及MSC對(duì)LPS致大鼠急性肺損傷的生物學(xué)作用和可能的機(jī)制，為干細(xì)胞治療急性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)線索。 方法和結(jié)果： 1．大鼠骨髓MSC的分離培養(yǎng)和鑒定 采用密度梯度離心和全骨髓貼壁分離法均能成功分離純化雄性大鼠骨髓MS

2、C，P4代細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)條形、梭形等成纖維細(xì)胞樣特征性形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志呈CD34-/CD45-/CD90+，并具有成骨、成脂肪分化潛能。 2．雄性MSC在雌性大鼠肺組織中的植入 制備雄性大鼠性別決定基因(Sry)探針，應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)觀察靜脈注入雄性MSC后，雄性MSC在雌性大鼠肺組織中的植入。結(jié)果顯示給予LPS和生理鹽水(NS)組沒(méi)有檢測(cè)到呈sry基因陽(yáng)性的細(xì)胞，給予NS和MSC組僅在6

3、h和1d發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，給予LPS和MSC組直到3w仍有陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞存在于肺泡腔內(nèi)側(cè)和間質(zhì)，分布不均，損傷較重的部位更明顯，但陽(yáng)性細(xì)胞總體比例不高(＜10％)。 3．MSC對(duì)靜脈注射LPS致大鼠急性肺損傷生物學(xué)作用的體內(nèi)研究 65只雌性SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為①正常對(duì)照組(n=15)經(jīng)尾靜脈注射等量NS，2h后經(jīng)另一側(cè)尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只；②肺損傷組(n=25)，經(jīng)尾靜脈注射LPS8mg/kg

4、，2h后經(jīng)另一側(cè)尾靜脈注射等量NS；⑦M(jìn)SC干預(yù)組(n=25)，經(jīng)尾靜脈注射LPS8mg/kg，2h后經(jīng)另一側(cè)尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只。每組在注射MSC后6h、24h、4d、1w和3w處死動(dòng)物。結(jié)果顯示肺損傷組6hPaO267.1±11.6mmHg，較對(duì)照組顯著降低，肺組織病理表現(xiàn)為不同程度的充血和出血、肺泡破壞、間隔增寬、大量中性粒細(xì)胞聚集等表現(xiàn)，肺濕干比．BALF中總蛋白含量及肺組織MPO活性迅速升高，與正常對(duì)照組比較有

5、顯著差異(P＜0.01)；與肺損傷組比較，MSC干預(yù)組4d時(shí)對(duì)降低BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量．肺組織MPO活性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，顯著降低了血清促炎因子TNF-α和IL-1β濃度(P＜0.05)，對(duì)血清抗炎因子IL-10的作用不顯著，有提高動(dòng)物生存率和降低3w．點(diǎn)肺組織羥脯氨酸(HYP)含量的趨勢(shì)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.22和P=0.09)。 4．MSC對(duì)腹腔注射LPS致大鼠急性炎癥性肺損傷

6、治療作用的體內(nèi)研究 60只雌性SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為①空白對(duì)照組(n=20)經(jīng)腹腔注射等量NS；②肺損傷組(n=20)，經(jīng)腹腔注射LPS2mg/kg，1h后經(jīng)尾靜脈注射等量NS；⑦M(jìn)SC干預(yù)組(n=20)，經(jīng)腹腔注射LPS2mg/kg，1h后經(jīng)尾靜脈注射雄性MSC，1×106/只。每組在注射MSC后6h、24h、48h和2w處死動(dòng)物。肺損傷組肺組織病理表現(xiàn)為血管充血和以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的細(xì)胞數(shù)量增多，6h時(shí)即出現(xiàn)，2

7、4h時(shí)最明顯，48h時(shí)炎癥較前減退，2w時(shí)肺組織基本恢復(fù)正常。MSC干預(yù)組6h時(shí)肺組織病理較肺損傷組輕，24h時(shí)繼續(xù)減輕，48h時(shí)肺組織基本恢復(fù)正常。與肺損傷組相比，MSC干預(yù)組顯著降低了肺濕干比、BALF中總蛋白含量及肺組織中中性粒細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)，而且顯著降低了血清促炎因子TNF-α、IL-1β和MIP-1α濃度(P＜0.01)，但對(duì)抗炎因子IL-10的升高作用尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21)。 5．MSC與LPS

8、損傷的肺部細(xì)胞相互作用的體外研究 首先分離培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM)、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和肺細(xì)胞(LC)． (1)MSC與LPS損傷AM的相互作用 采用膜孔徑0.4um的Transwell小室，分為①M(fèi)SC單獨(dú)培養(yǎng)組②AM單獨(dú)培養(yǎng)組③MSC和AM直接共培養(yǎng)組④MSC和AM間接共培養(yǎng)組，分別以LPS損傷4h后，MSC和AM直接共培養(yǎng)組和間接共培養(yǎng)組均較AM單獨(dú)培養(yǎng)組顯著降低了培養(yǎng)液上清促炎因子TNF-α，I

9、L-1β和MIP-1α濃度(P＜0.05或0.01)，直接共培養(yǎng)組作用更顯著，對(duì)MIP-1α的降低作用與間接共培養(yǎng)組比較P＜0.05，并且升高了抗炎因子IL-10濃度，與AM單獨(dú)培養(yǎng)組比較P＜0.05． (2)MSC與LPS損傷肺部細(xì)胞的相互作用--MSC的體外遷移 采用膜孔徑3um的Transwell小室，上室接種MSC，下室分別接種AM、AM+EC和LC，分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予LPS損傷，共培養(yǎng)3d后，實(shí)

10、驗(yàn)組MSC遷移細(xì)胞數(shù)均較空白對(duì)照組明顯增多(P＜0.01)，遷移細(xì)胞的形態(tài)無(wú)變化，AM+EC組遷移細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色呈陰性。 結(jié)論： 1、骨髓MSC可成功分離純化，并在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。 2、骨髓MSC不僅在體內(nèi)能向損傷肺組織歸巢，抑制LPS誘導(dǎo)的局部和全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)急性炎癥性肺損傷的治療作用，而且，在體外也能向受損肺部細(xì)胞遷移，影響局部細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且這種作用除了直接接觸的機(jī)制外，還可能通