人臍帶間充質(zhì)干細胞對急性肺損傷氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、研究背景：
　　 急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的一種危重病癥，其基本特征為肺內(nèi)微血栓形成和大量炎性細胞浸潤，其發(fā)病機制尚未完全明確，故目前尚無有效的治療手段，其病死率高達40％。Lima等的研究證實氧化應(yīng)激在肺損傷模型的結(jié)構(gòu)、功能和炎癥反應(yīng)中都扮演了很重要的角色，這提示如果糾正氧化應(yīng)激失衡就有可能減輕急性肺損的程度，為急性肺損傷的治療提供新的方向與方法。
　　 間充質(zhì)

2、干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具備自我復(fù)制(self-renewal)和多向分化潛能的成體干細胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，而后在脂肪、肌肉等組織中都發(fā)現(xiàn)了這種特殊的細胞。因其特殊的生物學(xué)特性，間充質(zhì)干細胞現(xiàn)己經(jīng)逐漸成為組織工程和臨床再生醫(yī)學(xué)的重要種子細胞。當前，間充質(zhì)干細胞的主要來源仍然是骨髓。但由于它的獲取途徑為有創(chuàng)操作過程，且骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem

3、 cell，BMMSC)的數(shù)量和活性都隨著供者年齡的增長而顯著降低，且存在染毒風(fēng)險。以上的缺點，大大制約了間充質(zhì)干細胞在組織工程和臨床再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。目前，已有大量研究證實，人類臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)來源廣泛，無倫理學(xué)制約，且較骨髓來源的間充質(zhì)干細胞更易體外擴增，并具有更低的免疫原性，因而己經(jīng)越來越受到人們的重視，逐漸成為組織工程和再生醫(yī)

4、學(xué)中最具發(fā)展前景的種子細胞。HUMSCs的發(fā)現(xiàn)與成功分離有可能為急性肺損傷的治療帶來新的曙光。之前已有大量研究證明間充質(zhì)干細胞移植后不僅具有分化能力，還具有免疫調(diào)節(jié)等功能，但是國內(nèi)外罕有HUMSCs是否對急性肺損傷氧化應(yīng)激存在影響的相關(guān)報道。
　　 目的：
　　 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離，培養(yǎng)和鑒定，并探討其移植對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的可能影響。
　　 方法：
　　 1、人臍帶間充質(zhì)干細胞的

5、分離與培養(yǎng)
　　 無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶，用PBS沖凈殘留的血液，用眼科剪盡量剪碎，先用膠原酶Ⅱ消化30min，離心后再用胰酶消化30min，用100目濾網(wǎng)過濾除去未消化組織，加入含10％胎牛血清并已加入青/鏈霉素的DMEM/F12的完全培養(yǎng)基，接種到一次性細胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長到80％融合時，進行消化傳代和擴增培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細胞形念學(xué)改變并拍照記錄。
　　 2、人臍帶間充質(zhì)干細胞

6、表面標志鑒定
　　 用流式細胞儀檢測人臍帶來源問充質(zhì)干細胞CD29、CD34、CD44、CD105的表達情況。
　　 3、人臍帶間充質(zhì)干細胞多向分化能力鑒定
　　 油紅O染色法和茜素紅染色法分別鑒定HUMSCs向脂肪細胞和成骨細胞的分化能力。
　　 4、觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)的影響
　　 自各組大鼠左肺下葉取一小塊肺組織，用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包

7、埋、切片、HE染色。光鏡下觀察肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，并拍照。
　　 5、測定人臍帶間充質(zhì)于細胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織濕干重的影響
　　 自各組大鼠右肺下葉取一小塊肺組織，稱量濕重，然后置于恒溫烤箱烤至恒重，稱量干重，計算肺濕/干重比=濕重/干重。
　　 6、探討人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的影響
　　 將30只Wistar大鼠隨機分為生理鹽水(NS)對照組(A

8、組)、LPS模型組（B組）和HUMSCs移植組（C組），每組10只。移植6h后，處死各組大鼠，取肺組織行病理學(xué)觀察，肺濕/干重比測定，丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、組織碎塊消化第3天起，可見少量貼壁的細胞，形態(tài)較小，細胞核不明顯，其余大部分未消化的組織碎塊懸浮于培養(yǎng)液表面。隨著培養(yǎng)時間的延長，貼壁的細胞逐漸增多。約7天后，可見部分貼壁細胞呈扁平形或長梭形，10天后，貼壁

9、細胞明顯增多，可見典型的梭狀成纖維樣細胞，并呈漩渦狀生長，2周左右時可達80％融合。經(jīng)傳代培養(yǎng)，可得到逐漸純化的HUMSCs，同時細胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定，至少能傳代30代以上。
　　 2、流式細胞儀鑒定紡錘樣細胞高表達CD29、CD44和CD105，幾乎不表達造血系標志CD34，符合HUMSCs的表面標志特征。
　　 3、HUMSCs經(jīng)特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)后能分化為脂肪細胞或成骨細胞。
　　 經(jīng)油紅O染色后細胞核

10、呈藍色，脂滴呈紅色。對照組未見含紅色脂滴的細胞。經(jīng)茜素紅染色后細胞之間有大量的紅色鈣結(jié)晶析出，鈣結(jié)節(jié)呈圓形或多邊形，折光性強，對照組細胞排列緊密，未見鈣結(jié)節(jié)形成。
　　 4、HUMSCs移植能明顯減輕急性肺損傷時炎性細胞浸潤程度和肺組織的損傷程度。
　　 對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整光滑。LPS模型組肺組織水腫，少量出血，光鏡下觀察可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破壞，肺泡問隔增厚，上述病理形態(tài)改變符合ALI的表現(xiàn)。H

11、UMSCs移植組炎性細胞浸潤明顯減少，肺損傷程度較模型組顯著減輕。
　　 5、HUMSCs移植能減輕急性肺損傷時肺組織的水腫程度。
　　 與對照組比較，模型組肺W/D比明顯增加(P＜0.05)。與模型組比較，HUMSCs移植組肺W/D比明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6、HUMSCs移植能減少急性肺損傷時肺組織內(nèi)MDA的含量，并提高肺組織內(nèi)SOD的活性。
　　 與對照組比較，模型組肺組

12、織MDA含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比，HUMSCs移植組MDA含量明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照相比，模型組SOD活性明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，HUMSCs移植組SOD活性明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗結(jié)果顯示，B組在注射LPS后6h產(chǎn)生了明顯的肺部損傷，同時機體抗氧化應(yīng)激能力顯著下降。B組肺組織中MDA含量顯著高于A組，肺組織內(nèi)S

13、OD活性顯著低于A組。說明LPS所致的肺損傷使肺部發(fā)生了強烈的氧化應(yīng)激。這不僅可直接損傷肺泡上皮細胞及肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞，還可通過肺部脂質(zhì)過氧化反應(yīng)繼續(xù)產(chǎn)生大量氧自由基，并以多種途徑造成肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷。正常狀態(tài)下，機體抗氧化系統(tǒng)可以清除過量的氧自由基，使機體不會被氧自由基損傷。而注射LPS后，肺部發(fā)生了強烈的氧化應(yīng)激，機體抗氧化應(yīng)激能力不足，導(dǎo)致了嚴重的肺損傷。
　　 HUMSCs移植能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠AL