骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠肺移植急性排斥反應的保護作用.pdf

1、本文研究了骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠肺移植急性排斥反應的保護作用。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：
　　 目的：探討如何建立穩(wěn)定的小鼠原位左肺移植模型。
　　 方法：雄性FVB 小鼠隨機分成供體和受體，采用自創(chuàng)的三套管法建立小鼠原位左肺移植模型。
　　 結果：手術成功率在90％以上，冷缺血時間35.6±5.9min，熱缺血時間25.3±7.2min，供肺準備時間21±5.6min，整個手術時間85±15

2、min，術后受體存活時間達到30d以上，術后一月顯微CT 顯示左肺野清晰，左支氣管通暢，阻斷小鼠右側(cè)肺門前后，檢測動脈血氣，結果無顯著性差異。術后一月病理學檢查顯示肺移植物結構基本正常，與正常右側(cè)肺相似，肺泡通氣功能良好。
　　 結論：在大鼠原位左肺移植模型的基礎上，自行摸索，獨立地建立了成功的小鼠肺移植模型，與國外建立的該模型相比，我們的方法具有操作簡便易行，模型穩(wěn)定的特點，這在國內(nèi)屬于首創(chuàng)，為肺移植的基礎研究打下了堅實的基礎

3、。
　　 第二部分：
　　 目的：探討應用生物發(fā)光技術在體監(jiān)測小鼠肺移植排斥反應以及評價抗排斥反應藥物環(huán)孢霉素治療效果的可能性。在體監(jiān)測器官移植排斥反應具有很大的臨床應用前景。當前，診斷排斥反應的金指標是活組織檢驗，該方法不僅具有侵襲性，而且還可能造成樣本誤差。本研究的目的是為了探索采用生物發(fā)光顯像技術活體監(jiān)測肺移植排斥反應的可能性，并進一步使用該方法評價不同劑量抗排斥反應藥物環(huán)孢霉素的治療效果。
　　 方法：采

4、用表達生物熒光素酶-綠色熒光蛋白(Luc-eGFP)的轉(zhuǎn)基因L2G85小鼠(H-2q)作為供體，Balb/c(H-2d)或 FVB(H-2q)小鼠作為受體，建立小鼠左肺原位肺移植模型。定期檢測供體肺散發(fā)的生物熒光信號強度。不同的時間點處死實驗動物，取出供肺組織行HE 染色，觀察肺組織病理學改變。
　　 結果：所有肺移植物均在移植后7天左右排斥，生物熒光信號強度(BLI)在7天左右下降到基礎值的5％以下(1.35±0.1％)，到移

5、植后2周，移植物生物熒光信號降到背景水平。相反在同基因移植FVB 受體小鼠內(nèi)，生物熒光信號強度在2周仍然超過基礎強度的80％(89.6±4.5％)。我們同時使用不同劑量環(huán)孢霉素，抑制同種異體小鼠肺移植物的排斥反應，10mg/kg/d、20mg/kg/d和30mg/kg/d，生物熒光信號結果顯示，移植術后28天，20mg/kg/d組生物熒光信號強度與基礎值相比，遠大于10mg/kg/d組(41.05±4％ VS14.87±3％，P<0.0

6、5)，但是和30mg/kg/d組沒有很明顯的區(qū)別(41.05±4％ VS44.49±4％,P>0.05)。
　　 結論：生物熒光顯像技術能可靠地活體連續(xù)監(jiān)測小鼠肺移植排斥反應，并能監(jiān)測環(huán)孢霉素的免疫抑制效果，將來臨床上可以應用該策略，有利于建立個體化的抗排斥反應治療方案。
　　 第三部分：
　　 目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)具有調(diào)節(jié)免疫反應的作用。靜脈注射后，該細胞大量滯留在肺內(nèi)，滯留在肺內(nèi)的細胞是否能夠抑制

7、肺移植排斥反應呢？本實驗將對此展開研究并探討其可能的機制。
　　 方法：實驗分兩部分，第一部分，檢測骨髓間充質(zhì)干細胞移植后植入到肺內(nèi)的情況。1X106L2G85來源的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)尾靜脈分別注射至正常組、假手術組以及肺移植組小鼠體內(nèi)，通過監(jiān)測生物熒光信號強度來追蹤細胞的存活情況(n=5/組)。第二部分，研究骨髓間充質(zhì)干細胞移植對同種異基因肺移植物排斥反應的保護作用。使用L2G85小鼠為供體，Balb/c 小鼠為受體，建立小鼠

8、左肺原位移植模型，隨機分成3組，對照組、骨髓間充質(zhì)干細胞治療組和環(huán)孢霉素治療組(n=20/組)，對照組接受PBS100ul 尾靜脈注射，共5天；細胞治療組接受FVB小鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細胞尾靜脈注射，1X106/d，共5天；環(huán)孢霉素組接受環(huán)孢霉素20mg/kg/d 腹腔注射直到實驗終末時間點。移植術后第7天，處死部分實驗動物，切取肺移植物，流式細胞檢測移植術后移植肺內(nèi)浸潤的淋巴細胞中CD4+FOXP3+Treg以及CD8+IFN-γ+

9、Tc的比例；肺組織行HE 染色觀察組織的病理變化；切取受體脾臟，分離脾細胞行酶聯(lián)免疫斑點實驗檢測移植受體的免疫反應類型。部分實驗動物定期檢測供體肺散發(fā)的生物熒光信號強度直至移植后第21天。
　　 結果：第一部分實驗，在正常組、假手術組和肺移植組中，小鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞后，生物熒光顯像提示早期細胞主要滯留于肺內(nèi)，左右肺內(nèi)細胞信號強度基本相同，24h后左右肺內(nèi)細胞信號強度在三組中均急劇降低，肺移植組左肺下降幅度最小，肺移植

10、組右肺以及假手術組下降幅度其次，正常組下降幅度最大，第三天，除肺移植組左肺可以檢測到較強熒光信號外，其他組以及肺移植組右肺，熒光信號強度均降到背景水平；第二部分實驗，在移植術后第7天，與基礎值對比，骨髓間充質(zhì)干細胞治療組生物熒光信號強度與環(huán)孢霉素組相近，差異沒有顯著性(66.7±8％vs63.9±4.5％)P>0.05，骨髓間充質(zhì)干細胞組較PBS組生物熒光信號強，差異有顯著性(66.7±8％vs1.62±0.4％)P<0.05，在術后1

11、4天，PBS組信號降到背景水平，細胞移植組和環(huán)孢霉素組熒光信號強度相似，分別為基礎值的(42.3±3.5vs46.6±5.4％)，細胞移植組和環(huán)孢霉素組相比，差異沒有顯著性，P>0.05，細胞治療組、環(huán)孢霉素組與PBS組相比，差異有顯著性，P<0.05。但是到術后21天，骨髓間充質(zhì)干細胞治療組熒光信號顯著降低，略強于背景水平，為基礎值的0.21±0.5％，環(huán)孢霉素組熒光信號為基礎強度的41.64±3.5％，差異有顯著性，P<0.05。移

12、植術后第7天肺移植物病理切片結果顯示：骨髓間充質(zhì)干細胞治療組和環(huán)孢霉素治療組肺組織結構基本正常，肺泡通氣功能良好，但是PBS組顯示肺泡塌陷，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)淋巴細胞浸潤。在術后第7天，供肺移植物浸潤淋巴細胞中，MSC細胞治療組CD4+FOXP3+Treg 所占比例顯著高于PBS組(32.04±2.5％ VS15.5±1.7％)P<0.05。CD8+IFN-γ+細胞毒性T 淋巴細胞所占比例明顯低于PBS組(27.6±1.4％ VS 5

13、5.2±6.7％)P<0.05。酶聯(lián)免疫斑點實驗結果顯示，IFN-γ 斑點在三組中分別為：PBS組404±35/106細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞組為200±23/106細胞，環(huán)孢霉素組為196±26/106細胞，IL-4 斑點在三組中分別為：PBS組為38.7±5.4/106細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞組為75±10/106細胞，環(huán)孢霉素組為18±2.9/106細胞。
　　 結論：在此實驗中，我們證實了，靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞后，細胞早