骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤組織作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的: 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）接種于小鼠Heps肝癌移植瘤，測(cè)量腫瘤體積變化，記錄小鼠生存期，并觀察MSC接種后移植瘤局部免疫效應(yīng)及腫瘤細(xì)胞促血管生成因子表達(dá)的變化，分析MSC對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤組織的作用機(jī)制，為MSC用于肝癌治療的可能性及安全性提供理論依據(jù)。
　　 方法: 體外貼壁培養(yǎng)法制備昆明小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分離培養(yǎng)傳代擴(kuò)增，流式細(xì)胞儀鑒定MSC表型。4'，6-二

2、脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對(duì)MSC進(jìn)行標(biāo)記備用。隨機(jī)取54只8周齡雄性昆明小鼠，接種Heps肝癌細(xì)胞于其皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。移植瘤長(zhǎng)徑達(dá)0.5～0.8cm時(shí)，隨機(jī)分為3組，分別為MSC接種組（以下簡(jiǎn)稱MSC組）、DAPI標(biāo)記MSC接種組（以下簡(jiǎn)稱DAPI組）、生理鹽水對(duì)照組（(以下簡(jiǎn)稱NS對(duì)照組)），每組18只。MSC組及DAPI組分別在小鼠Heps肝癌移植瘤

3、內(nèi)注射2×106MSC及DAPI標(biāo)記的MSC，NS對(duì)照組注射同體積的生理鹽水。每組各有6只荷瘤小鼠用于觀察生存期。（1）自注射日起，隔日測(cè)量各組小鼠腫瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算注射后3d、7d、14d及28d時(shí)腫瘤體積。（2）記錄注射當(dāng)天開始至小鼠死亡的時(shí)間，計(jì)算各組小鼠平均生存時(shí)間。（3）于注射后3d、7d、14d及28d，各組分批處死3只小鼠。取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅（hematoxylin-esosin，HE）染色后光學(xué)顯微

4、鏡觀察。（4）取各組小鼠上述時(shí)間點(diǎn)的腫瘤組織切片，分別應(yīng)用CD4抗體、CD8抗體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體，行免疫組織化學(xué)染色。計(jì)數(shù)局部腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量，并應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。（5）取各組小鼠上述時(shí)間點(diǎn)的血清，通過雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorben

5、t assay，ELISA），檢測(cè)干擾素（interferon，IFN）-γ和白介素（interleukin，IL）-12的水平。（6）取注射MSC7d后DAPI組小鼠腫瘤組織，行熒光冰凍切片檢測(cè)瘤體內(nèi)DAPI標(biāo)記的MSC。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外貼壁法成功制備MSC，得到比較純化的MSC，流式細(xì)胞儀對(duì)第3代MSC進(jìn)行鑒定，高表達(dá)CD29（97.84％），低表達(dá)CD34(5.56％)、CD45（7.66％）。

6、>　　 2.小鼠Heps肝癌腹水瘤細(xì)胞成功制備小鼠Heps肝癌移植瘤模型，成瘤率100％。
　　 3.對(duì)DAPI組行熒光冰凍切片檢測(cè)，在腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)DAPI標(biāo)記的MSC藍(lán)色熒光，說明標(biāo)記及注射成功。
　　 4.注射MSC后3d至7d，MSC組及DAPI組腫瘤體積增大明顯，與NS對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）。接種MSC后14d及28d時(shí)，各組小鼠腫瘤體積均較前增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　

7、 5.MSC組平均生存期為45天（95％可信區(qū)間：33～56天），DAPI組平均生存期為34天（95％可信區(qū)間：31～37天），NS對(duì)照組平均生存期為33天（95％可信區(qū)間：28～37天），其中，MSC組與NS組有顯著差異（P<0.05），其余組間生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 6.各組小鼠腫瘤HE染色：注射后3d及7d，MSC組及DAPI組腫瘤細(xì)胞分布密集，胞漿豐富，異性型明顯，可見病理性核分裂相，小片狀壞死灶

8、，免疫細(xì)胞少見。NS對(duì)照組可見瘤細(xì)胞退變明顯，呈空泡變性，腫瘤中間血管豐富，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯壞死灶；14d及28d時(shí)，MSC組及DAPI組腫瘤細(xì)胞形態(tài)消失，呈凝固性壞死，組織結(jié)構(gòu)不清，壞死明顯，范圍較對(duì)照組更大。NS對(duì)照組腫瘤細(xì)胞可見核固縮、核碎裂，片狀壞死，血管破壞嚴(yán)重。
　　 7.各組小鼠腫瘤CD4-IHC染色：注射后3d，MSC組癌巢內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯低于NS對(duì)照組（P<0.01），DAPI組CD4+T細(xì)胞數(shù)

9、量也下降，與NS對(duì)照組比較有差異性（P<0.05）。注射后7d，MSC組及DAPI組癌巢內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量仍無明顯增多，與NS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 8.各組小鼠腫瘤CD8-IHC染色：注射后3d，MSC組癌巢內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性下降，與NS對(duì)照組比較有差異性（P<0.05）。注射后7d，MSC組及DAPI組CD8+T細(xì)胞數(shù)量無明顯增加，與NS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<

10、br>　　 9.各組小鼠腫瘤VEGF-IHC染色：注射后3d，MSC組及DAPI組癌巢內(nèi)VEGF表達(dá)明顯下降，與NS對(duì)照組比較有明顯差異（P<0.01）。注射后28d，MSC組VEGF表達(dá)仍低于NS對(duì)照組（P<0.01）。
　　 10.ELISA結(jié)果顯示，注射后3d，MSC組及DAPI組血清IL-12及IFN-γ的濃度較NS對(duì)照組明顯降低（P<0.01）。注射后7d，MSC組血清IFN-γ的濃度降低更為明顯，與NS對(duì)照組比較有

11、顯著差異性（P<0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1. 體外貼壁法成功制備MSC；利用小鼠Heps肝癌瘤源腹水成功制備原發(fā)性肝癌Heps荷瘤小鼠模型，成瘤率100％；DAPI成功標(biāo)記MSC。
　　 2. MSC可在原發(fā)性肝癌Heps荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)定植，MSC接種后早期降低CD4+T、CD8+T表達(dá)，減少IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，抑制荷瘤小鼠T細(xì)胞免疫，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 3. MSC