間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠心臟死亡供體移植肝的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分規(guī)范化小鼠心臟死亡供體肝移植模型的構(gòu)建
　　[目的]肝臟移植是治療終末期肝病的唯一有效治療手段。而供肝短缺成為嚴(yán)重制約肝臟移植發(fā)展的難題。心臟死亡供體(DCD)器官捐獻(xiàn)成為增加供肝來(lái)源的重要策略。由于難以避免的冷熱缺血損傷，心臟死亡供體捐獻(xiàn)的肝臟面臨著短期移植物失功和遠(yuǎn)期膽道并發(fā)癥等系列問(wèn)題。如何減輕損傷，提高心臟死亡供肝的質(zhì)量成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。小鼠在移植免疫、缺血再灌注損傷等方面具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但目前尚無(wú)較

2、好的小鼠模型研究心臟死亡供體相關(guān)肝移植的損傷，因此需要構(gòu)建一套統(tǒng)一規(guī)范的小鼠無(wú)心跳供體肝移植模型，為科研工作者進(jìn)行相關(guān)研究提供動(dòng)物平臺(tái)。
　　[方法]本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一套規(guī)范化的小鼠心臟死亡供體肝移植模型，該模型采用動(dòng)脈重建的方式，以熱缺血時(shí)間的長(zhǎng)短為依據(jù)對(duì)心臟死亡供體肝移植后的存活時(shí)間和肝臟變化進(jìn)行了研究，以確定最佳動(dòng)物模型時(shí)間。
　　[結(jié)果]供體心臟停跳0min、5min、10min和20min后進(jìn)行肝臟移植，移植術(shù)后7天的

3、受體存活率分別為100％，75％，37.5％和12.5％。隨著心臟停跳時(shí)間的延長(zhǎng)，移植術(shù)后6h的血清ALT和AST水平顯著升高，肝臟組織病理切片顯示移植肝細(xì)胞從水腫到點(diǎn)狀壞死再到片狀壞死的變化過(guò)程;術(shù)后移植肝內(nèi)IL1α、IL1β、TNFα、IFNγ、IL6、IL10及Kupffer細(xì)胞標(biāo)志物F4/80呈現(xiàn)普遍下降趨勢(shì)。
　　[結(jié)論]隨著供體無(wú)心跳時(shí)間的延長(zhǎng)，供肝的缺血/再灌注損傷加重，質(zhì)量顯著下降，移植術(shù)后供肝內(nèi)免疫細(xì)胞呈現(xiàn)低免疫

4、應(yīng)答狀態(tài)，Kupffer細(xì)胞受損喪失，受體存活率顯著下降。經(jīng)過(guò)比較，供體心臟停跳10min為理想的建模條件，可以保證移植術(shù)后受體一定的存活率，同時(shí)便于觀察干預(yù)措施是否有效。
　　第二部分間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠心臟死亡供體移植肝的保護(hù)作用研究
　　[目的]間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有多向分化潛能，被證實(shí)擁有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠安全有效的應(yīng)用于各種炎癥、缺血再灌注損傷、自身免疫性疾病模型中。近年來(lái)，MSC被逐漸應(yīng)用到重癥肝炎、肝衰

5、竭乃至肝癌等肝臟疾病領(lǐng)域，成為研究熱點(diǎn)。在肝臟移植領(lǐng)域，MSC因其能夠抑制免疫排斥反應(yīng)，減少免疫抑制劑用量得到了越來(lái)越多的重視和青睞，而MSC能否對(duì)心死亡供體捐獻(xiàn)的移植肝起到有效的保護(hù)作用還不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)利用構(gòu)建的小鼠心臟死亡供體的肝移植模型，驗(yàn)證MSC能否起到保護(hù)移植術(shù)后心臟死亡供肝的作用。
　　[方法]利用第一部分中構(gòu)建的規(guī)范的小鼠心臟死亡供體肝移植模型，控制心臟停跳時(shí)間為10min，采用MSC過(guò)繼輸注的方法進(jìn)行細(xì)胞治療，以

6、觀察術(shù)后受體存活時(shí)間和術(shù)后6h肝臟功能及病理指標(biāo)，評(píng)價(jià)MSC對(duì)心臟死亡供肝的保護(hù)作用。
　　[結(jié)果]MSC的過(guò)繼輸注可以使心臟停跳10min供肝移植后的7天存活率從37.5％顯著提升至100％，同時(shí)有效減輕術(shù)后6h外周血中肝臟ALT、AST的表達(dá)和肝臟組織損傷，病理結(jié)果顯示MSC使移植肝的肝細(xì)胞出現(xiàn)極輕微的水腫，有別于對(duì)照組肝臟細(xì)胞大范圍水腫、點(diǎn)狀壞死。同時(shí)長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，MSC治療組術(shù)后3月的存活率高達(dá)75％，肝功及病理切片顯示供

7、肝正常。
　　[結(jié)論] MSC的過(guò)繼輸注可以有效保護(hù)心臟死亡供體移植肝的質(zhì)量，減輕肝臟損傷，從而有效提高受體術(shù)后存活率。長(zhǎng)期觀察亦證實(shí)MSC的過(guò)繼輸注安全有效，并且不會(huì)存在誘發(fā)腫瘤的危險(xiǎn)。
　　第三部分間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)小鼠心臟死亡供體移植肝的作用機(jī)制研究
　　[目的]心臟死亡供體捐獻(xiàn)的肝臟不可避免的存在熱缺血/冷缺血/再灌注的損傷，其中又以熱缺血對(duì)供肝的損傷最為明顯。在有效循環(huán)灌注喪失的情況下，肝臟進(jìn)入乏氧狀態(tài)，肝內(nèi)的

8、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞對(duì)乏氧非常敏感，其中Kupffer細(xì)胞對(duì)病理因素的應(yīng)答對(duì)于肝臟的免疫狀態(tài)起到至關(guān)重要的作用。前述部分，分別證實(shí)了心臟停跳時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低肝臟內(nèi)Kupffer細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)MSC對(duì)無(wú)心跳供肝具有保護(hù)作用，但MSC和Kupffer細(xì)胞之間是否存在聯(lián)系尚未得知，且MSC具體通過(guò)哪種機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)利用上述動(dòng)物模型，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡述MSC對(duì)供肝保護(hù)作用的機(jī)制。
　　[方法]利用氯化釓(GdCl3)清除供肝體

9、內(nèi)的Kupffer細(xì)胞后進(jìn)行無(wú)心跳肝移植，同時(shí)進(jìn)行MSC過(guò)繼輸注，觀察術(shù)后受體存活情況，明確MSC和Kupffer細(xì)胞是否存在聯(lián)系。利用qRT-PCR法、Immunoassay法、免疫組化及體外細(xì)胞共培養(yǎng)等方法探究MSC發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制。
　　[結(jié)果]過(guò)繼輸注MSC顯著提升了移植肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞表面F4/80的表達(dá)，同時(shí)GdCl3清除供肝Kupffer細(xì)胞后，MSC失去了對(duì)供肝的保護(hù)作用，受體術(shù)后生存率顯著下降。在保護(hù)

10、Kupffer細(xì)胞的同時(shí)，MSC的過(guò)繼輸注使促炎介質(zhì)、趨炎因子等的表達(dá)均顯著下降。體外細(xì)胞共培養(yǎng)證實(shí)，MSC可以減少過(guò)氧化物引起的Kupffer細(xì)胞凋亡，PGE2抑制劑則逆轉(zhuǎn)這一保護(hù)作用，蛋白印記證實(shí)MSC可以抑制Kupffer細(xì)胞表達(dá)TLR4，進(jìn)而激活ERK1/2，減少Fas/FasL的表達(dá)，減少caspase3的激活，從而抑制Kupffer細(xì)胞凋亡。
　　[結(jié)論] MSC主要通過(guò)PGE2減少缺血再灌注損傷中Kupffer細(xì)胞的