穩(wěn)定表達Foxp3的間充質(zhì)干細胞對大鼠移植肝免疫保護作用的研究.pdf

1、第一部分大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反應(yīng)模型的建立
　　目的:建立大鼠原位肝移植模型及穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型。
　　方法:預(yù)實驗采用SD大鼠，共進行操作大鼠肝移植100例，其中定型手術(shù)70例。在此基礎(chǔ)上，建立20例SD大鼠到SD大鼠原位肝移植模型，20例DA大鼠到Lewis大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型。檢測受體肝功能，觀察生存期，根據(jù)Banff分級評分方案來評價排斥反應(yīng)的強度。
　　結(jié)果:后期40例定型手

2、術(shù)中:無肝期為16.76±2.86 min，手術(shù)成功率為90.25％，1W存活率為80.00％，手術(shù)效果較前期30例明顯改善(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。SD→SD組受體平均存活時間41.27±6.25天，術(shù)后第7天肝功能基本正常，肝組織病理無明顯變化，RAI評分1.76±0.75分。DA→Lewis組受體平均存活時間9.66±1.38天，術(shù)后第7天ALT，AST及TBIL水平較前者明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)，RAI

3、評分為7.70±0.81，屬于嚴重急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)。
　　結(jié)論:采用改良Kamada's“二袖套法”，改進肝上下腔靜脈的重建及肝臟的灌注方法，成功建立大鼠原位肝移植模型。DA→Lewis大鼠之間的原位肝移植是穩(wěn)定的肝移植急性排斥反應(yīng)模型。
　　第二部分重組人Foxp3基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在MSC細胞上的表達
　　目的:制備攜帶人Foxp3基因的慢病毒載體并在MSCs上表達
　　方法:設(shè)計及合成適當(dāng)?shù)囊?，從H

4、ela細胞上PCR擴增得到Foxp3基因，與FUGW載體產(chǎn)生粘性末端。將Foxp3基因片段和載體FUGW載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3細胞，產(chǎn)生重組慢病毒質(zhì)粒Foxp3-FUGW。再將重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細胞后包裝出慢病毒顆粒，并進行病毒感染滴度的測定，最后將慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至DA鼠源的MSCs。
　　結(jié)論:構(gòu)建攜帶人Foxp3基因高純度、高滴度的重組慢病毒載體Foxp3-FUGW，F(xiàn)oxp3-FUGW能感染MSC細胞并在MS

5、C細胞中表達。
　　第三部分穩(wěn)定表達Foxp3的MSCs對免疫調(diào)節(jié)作用的影響
　　目的:探討MSC-Foxp3在混合淋巴細胞培養(yǎng)中對同種異體CD4+T淋巴細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，并初步探討其作用機制。
　　方法:建立MSCs和同種異體淋巴細胞共培養(yǎng)體系，反應(yīng)體系總量200ul。以DA大鼠的脾臟淋巴細胞為刺激細胞，以Lewis大鼠的CD4+T細胞為反應(yīng)細胞，分為4組。所有組別按1∶1比例加入刺激細胞和反應(yīng)細胞，細胞數(shù)為1

6、×106/ul。A組:對照組，加入1ml PBS緩沖液;B組:加入1ml MSCs(1×106/ul);C組:加入1ml MSC-Foxp3(1×106/ul);D組:加入1ml MSC-Foxp3(1×106/ul)+Transwell。各組MSCs均源自DA大鼠?；旌吓囵B(yǎng)5天，加入3H-TdR1微居，以液閃測定儀測定各組的CPM值;混合培養(yǎng)7天，上清ELISA法檢測TNF-α、INF-γ、TGF-β及IL-10的含量。
　　結(jié)

7、果:相比于MSCs，穩(wěn)定表達Foxp3的MSCs更能抑制CD4+T細胞的增殖(P＜0.05)，減少TNF-α、IFN-γ的含量及增加TGF-β、IL-10的含量(P＜0.05);用Transwell實驗來阻斷MSC-Foxp3與T細胞的直接接觸，MSC-Foxp3+Transwell顯著恢復(fù)CD4+T細胞的增殖(P＜0.05)，TNF-α、IFN-γ的含量回升(P＜0.05)，TGF-β、IL-10的含量回落（P＜0.05）。
　

8、　結(jié)論:
　　(1) MSCs過表達Foxp3后，相比未修飾的MSCs免疫調(diào)節(jié)能力更強大;
　　(2) MSC-Foxp3的免疫抑制機制可能類似于MSCs，可能包括細胞與細胞接觸和分泌可溶性因子。
　　第四部分 MSC-Foxp3對大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的影響
　　目的:研究MSC-Foxp3對肝移植后急性排斥反應(yīng)的抑制作用并探討其相關(guān)機制。
　　方法:供體選用雄性DA大鼠，受體選用雄性Lewis大鼠。采

9、用改良Kamada's“二袖套法”建立肝移植模型。實驗動物隨機分成4個組:A組為假手術(shù)組(n=8);B組為對照組(n=16)，移植后24h靜脈注射PBS緩沖液;C組為MSCs組(n=16)，移植后24h靜脈注射DA來源的MSCs(2×106);D組為MSC-Foxp3組(n=16)，移植后24h靜脈注射DA來源的MSC-Foxp3(2×106)。B、C和D組分成2個亞組(n=8)，一個亞組觀察大鼠移植后生存期，另一亞組分別于移植后7d處

10、死大鼠，檢測血清ALT，AST，TBIL水平;部分肝組織冰凍切片熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，余肝組織石蠟包埋后行HE染色，進行病理組織學(xué)檢查并進行評分（根據(jù)Banf分級評分方案）;ELISA法測定IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β的含量;流式細胞儀檢測脾臟組織中CD4+、CD8+、CD4+CD25+Treg細胞比例。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡下觀察經(jīng)過病毒感染表達FOXP3的MSC細胞（綠色）在肝臟中有散在分布;與B組比較

11、，C、D組生存期均延長(P＜0.05)，且D組較C組明顯延長(P＜0.05)，差異均有顯著性;與B組比較，移植術(shù)后7d，C、D組血清中ALT，AST，TBIL水平均降低(P＜0.05)，且D組較C組明顯降低(=P＜0.05)，差異均有顯著性;與B組比較，C、D組排斥反應(yīng)評分(RAI)均降低(P＜0.05)，且D組較C組降低(P＜0.05)，差異均有顯著性;與B組比較，C、D組血清中IL-2和IFN-γ的含量均降低(P＜0.05)，且D組

12、較C組相比明顯降低(P＜0.05)，IL-10和TGF-β的含量在各組則相反，差異均有顯著性;與B組比較，C、D組脾組織中CD4+細胞比例均升高(P＜0.05)，且D組較C組明顯升高(P＜0.05)，CD8+細胞比例在各組則相反，差異均有顯著性;與B組比較，C、D組CD4+CD25+Treg細胞比例均升高(P＜0.05)，且D組較C組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) MSC-Foxp3能明顯減輕大鼠同種異體