聯合間充質干細胞培養(yǎng)對大鼠移植胰島的保護作用.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病是一種普遍的復雜代謝性疾病，WHO最近公布的數據表明：在全球成人人口中估計有171，000，000例糖尿病病人的發(fā)病率，到2025年將達到3億人，糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。它可導致嚴重的長期的微血管及大血管并發(fā)癥，并由此帶來較高的致病率與死亡率。我國人口患病率已接近5％，與發(fā)達國家類似。盡管在世界范圍內糖尿病人口中，1型糖尿病的比例只占到1096，但其因持續(xù)增長的發(fā)病率(歐洲

2、高達41/100，000人口/年、北美高達25/100，000人口/年)而成為主要的全球性健康問題。
　　 1型糖尿病是T淋巴細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，可導致β細胞破壞及胰島素分泌的減少。其特征表現為抗胰島細胞抗體的出現(目前診斷1型糖尿病的最佳標準)、嚴重的胰島素缺乏及表明胰腺β細胞被自身免疫破壞的證據。1型糖尿病的標準治療方案為嚴格控制的建立在嚴密血糖檢測基礎上的各種胰島素注射治療。但是皮下注射不能準確模仿正常胰島

3、素分泌的生理過程，所以在治療過程中還需要嚴格的飲食控制，同時也增加了并發(fā)嚴重低血糖的風險。
　　 當前，達到并維持正常血糖，同時避免低血糖風險的唯一途徑，就是胰島替代治療：胰腺移植及胰島移植。β細胞替代療法在經過選擇的1型糖尿病人中，已經部分的成功逆轉了腎及神經系統的長期并發(fā)癥。在最近的20余年，胰腺移植治療1型糖尿病取得了較好的效果。同時，關于胰島移植的研究已經取得了顯著的成果。首先，人胰島移植治療糖尿病已有成功的報道：Sha

4、piro等報道了接受胰島移植的36例病人中，有21例(58％)在隨后的1年里脫離了胰島素治療，其中有5例病人徹底脫離胰島素治療的時間維持了2年。Ryan等在65例接受了胰島移植病例的5年研究中，報道了脫離胰島素依賴的中位時間為15個月。實際上，有大約10％的病例保持了長期的脫離胰島素依賴狀態(tài)；第二，胰腺保存技術的改進、胰島分離率的提高以及合理的免疫抑制劑方案和抗炎治療的應用，使胰島移植取得了同胰腺移植相近的效果；第三，實驗表明，干細胞分

5、化的胰島細胞能夠逆轉糖尿病，這預示著胰島移植有著潛在無限的組織來源。
　　 胰島細胞移植已被證實可以有效降低血糖，使糖尿病患者由胰島素依賴型轉為非依賴性，或減少胰島素的用量，并可在很大程度上改善患者依靠胰島素治療時不能防止的糖尿病慢性并發(fā)癥；此外胰島細胞移植還具有安全、基本無創(chuàng)傷性、并發(fā)癥少及易重復多次移植的特點。胰島移植被認為是徹底治愈1型糖尿病并阻止其并發(fā)癥進展的最終方案。
　　 胰島的移植量至少要達到全胰的10％～

6、20％才能維持正常血糖和糖基化血紅蛋白水平。胰腺胰島的數量僅占胰腺細胞總數的2％，并且很難從大塊的胰腺外分泌腺體組織中分離及純化。由于胰島分離純化過程中的損傷，分離時間較長，以及移植后短時間內沒有血供建立，造成了胰島凋亡和死亡。一般需2到4個供體的胰島才能使患者完全脫離胰島素，胰島移植登記合作機構在2006年度報告中，報道了自1999年到2005年期間，共進行了225例胰島移植。約2/3的受體1年內脫離了胰島素依賴(定義為至少14天不需

7、胰島素干預治療)，而在第2年該比例下降到1/3。
　　 1型糖尿病未來的主要治療目標是促進β細胞的再生，可以由β細胞的自我復制或利用干細胞技術進行祖細胞的定向分化從而逃避自身免疫并促進內源性胰島素的分泌來實現。
　　 目前國內外學者正積極進行以下幾個方面的研究：①改進胰島的分離技術，以獲得足夠數量和高質量的胰島。②研究對胰島沒有毒性的免疫抑制方案。③利用干細胞技術和異種移植來克服胰島來源短缺。如能延長胰島體外培養(yǎng)時間并使

8、其保持良好的功能，將能大大減少移植所需的胰島用量，從而突破胰島移植數量受限的的瓶頸，使糖尿病的治療獲得新的發(fā)展。
　　 由于間充質干細胞能夠誘導免疫耐受，并且在體外具有向胰島素分泌細胞定向分化的潛力，上述特性可以達到1型糖尿病的主要治療目標，所以其作為1型糖尿病一種治療選擇的代表而引起人們的關注。
　　 MSC最早是從骨髓分離出的成體干細胞。1976年Friedenstein發(fā)現骨髓單核細胞在塑料培養(yǎng)皿中形成的貼壁細胞易

9、于提取、分離及擴增，可在一定條件下向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞分化，并且在體外擴增數十代后仍能保持其多向分化潛能，并且在損傷環(huán)境下還可以誘導擴增，參加組織修復或者再生反應，因此這類細胞被命名為“MSC”。MSCs能分泌多種造血及非造血生長因子、白介素和趨化因子，如M-CSF、SCF、FIT-3配基、TPO、IL-6、7、8、11、12、14、15和LIF等。這些細胞因子在造血干細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用。目前主要是根據其形態(tài)、抗

10、原表型及分化潛能來鑒定MSCs。MSCs高表達MHCⅠ類分子、SH2，SH3，CD29，CD44，CD73，CD90，CD106，CD120a，CD124，低表達MHCⅡ類分子及Fas配體，不表達造血細胞表面標志CD34，CD45，CD14，CD117和與移植免疫排斥發(fā)生密切相關的表面標志HLA-DR，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，CD40及Fas凋亡受體等，這表明MSCs在免疫調節(jié)中具有重要作用，預示著植入MSCs后不會

11、引起或引起極低的免疫排斥反應。
　　 本課題的第一部分是利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合提取、純化4周齡Wistar大鼠的骨髓間充質干細胞并培養(yǎng)傳代，得到數量、活性、純度高而較均一的骨髓間充質干細胞，應用流式細胞術鑒定其純度，為下一步聯合培養(yǎng)打下基礎。
　　 MSCs能夠誘導免疫耐受。有研究表明骨髓間充質干細胞具有組織同源性，聯合胰島移植時，其可以抑制T細胞激活，從而使受體與移植胰島形成微嵌合狀態(tài)，使移植術后不用長期服

12、用抗排斥藥物，達到移植胰島的長期存活。
　　 胰島的死亡，包括分離和培養(yǎng)過程中β-細胞的丟失，仍然是成功胰島移植中的重大障礙。胰島細胞死亡(包括細胞凋亡和β-細胞失活)的主要原因是因為胰島分離純化及培養(yǎng)過程中移植胰島缺氧及營養(yǎng)缺失。因此為了阻止胰島的死亡和加強移植胰島的功能，出現了許多改善細胞培養(yǎng)條件的手段。
　　 近年來的研究表明間充質干細胞可通過分泌營養(yǎng)因子、抗炎性因子、抗凋亡因子或者通過細胞-細胞接觸、融合等方式參

13、與組織器官的損傷修復，維持正常組織細胞功能。目前對于MSCs對移植胰島的潛在營養(yǎng)作用目前尚未完全清楚，盡管已有研究證實由MSCs分泌的因子如白介素-6(IL-6)，血管內皮生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子(HGF)，可以提高移植后移植胰島的質量。但是，對間充質干細胞作為滋養(yǎng)細胞來產生營養(yǎng)作用及相關分子信號級聯傳導的機制仍然知之甚少。
　　 本實驗第二部分利用間充質干細胞與移植胰島聯合培養(yǎng)，觀察其在延長胰島體外存活時間、保護胰

14、島功能等方面的作用。為胰島移植前如何有效的保存移植胰島的功能做一定的探索。
　　 第一部分間充質干細胞的提取、純化、傳代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：
　　 建立Wistar大鼠的骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離、體外培養(yǎng)方法，為進一步的研究打基礎。
　　 方法：
　　 利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合提取、純化4周齡Wistar大鼠的骨髓間充質干細胞并培養(yǎng)傳代擴增，得到數量、活性、純度高而較均一的

15、骨髓間充質干細胞，應用流式細胞術鑒定其純度。使用trypan blue染色鑒定其活性。
　　 結果：
　　 骨髓間充質干細胞培養(yǎng)傳代3代后流式細胞術檢測CD45陰性率為94％，CD90陽性率為95％，兩者熒光強度有顯著性差異，活性均大于95％，純度及活性均達到了進一步臨床實驗的要求。
　　 結論及意義
　　 利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合來分離、培養(yǎng)、純化及擴增骨髓間充質干細胞，可以獲得高活性高純度的

16、MSCs，是實用、便捷和可行的方法。同時對成功培養(yǎng)過程中注意事項加以總結，為下一步聯合移植胰島培養(yǎng)提供種子細胞打下了基礎。
　　 第二部分聯合間充質干細胞培養(yǎng)對大鼠移植胰島的保護作用的研究
　　 目的：
　　 有研究證明骨髓間充質干細胞除了可在特定條件下跨胚層分化為多種組織細胞外，還可通過分泌細胞因子或者通過細胞-細胞接觸、融合等方式參與組織器官的損傷修復，維持正常組織細胞功能。本研究探討間充質干細胞與移植胰島聯

17、合培養(yǎng)在延長胰島體外存活時間、保護胰島功能等方面的作用。
　　 方法：
　　 使用Histopaque-1077一步法，建立密度梯度來分離純化Wistar大鼠胰島，并對提取胰島的數量和活性進行評估；25只Wistar大鼠每只老鼠提取直徑在50μm以上的胰島按隨機對照表法將胰島培養(yǎng)分單純胰島基礎培養(yǎng)、單純胰島高糖培養(yǎng)、胰島與間充質干細胞聯合基礎培養(yǎng)、胰島與間充質干細胞聯合高糖培養(yǎng)四組，每組又分3小組(3d組、7d組、14d

18、組)，15孔/組；觀察胰島形態(tài)變化及胰島存活率，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測胰島素分泌量及刺激指數。
　　 結果：
　　 聯合培養(yǎng)組3d、7d、14d的胰島存活率均顯著高于單純培養(yǎng)組，P<0.01；高糖刺激下聯合培養(yǎng)組7d的胰島素分泌量及刺激指數均高于單純培養(yǎng)組，P<0.01。
　　 結論：
　　 間充質干細胞與胰島聯合培養(yǎng)可以明顯延長胰島體外存活時間并保持其活性，對胰島具有良好的保護作用。