骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素腎病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：1、分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），并鑒定其相關(guān)生物學(xué)特性。
　　2、通過注射鹽酸阿霉素建立大鼠阿霉素腎病模型。
　　3、通過電鏡觀察，檢測(cè)生化，應(yīng)用RT-PCR、Real time PCR、Western blot和ELASA技術(shù)觀察BMSCs移植和強(qiáng)的松治療保護(hù)大鼠阿霉素腎病的效果，并對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在阿霉素腎病大鼠中保護(hù)作用及機(jī)

2、制進(jìn)行探討。
　　方法：1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的提取、培養(yǎng)與鑒定：通過大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞層，密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法分離培養(yǎng)，不斷傳代、擴(kuò)增，并通過流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志鑒定與成骨和成脂誘導(dǎo)這兩種方法結(jié)合起來鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　2、大鼠阿霉素腎病模型建立：通過非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素，注射鹽酸阿霉素14d后，綜合各項(xiàng)結(jié)果：一般表現(xiàn)，24

3、h尿蛋白定量、肌酐等各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合腎臟組織HE染色及電鏡形態(tài)學(xué)觀察是否符合大鼠阿霉素腎病模型的要求。
　　3、BMSCs對(duì)阿霉素腎病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的研究：①實(shí)驗(yàn)分組：模型組；強(qiáng)的松組；MSC組；正常對(duì)照組。②采用電鏡觀察干預(yù)后4w各實(shí)驗(yàn)組腎臟足細(xì)胞結(jié)構(gòu)；采用常規(guī)生化檢測(cè)方法動(dòng)態(tài)觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠24h尿蛋白定量、肌酐等各項(xiàng)生化指標(biāo)。③應(yīng)用ELASA檢測(cè)單核細(xì)胞趨化因子-1（Monocyte chemotactic

4、 protein-1，MCP-1）在不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中表達(dá)改變情況。④應(yīng)用RT-PCR、Real time PCR和western blot技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察足細(xì)胞裂孔膜蛋白及骨架相關(guān)蛋白nephrin、podocin、synaptopodin，p21，MCP-1在各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)mRNA水平和蛋白水平表達(dá)改變情況。
　　結(jié)果：1、通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs細(xì)胞易分離，培養(yǎng)，細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞的表

5、面抗原特征，不具有造血干細(xì)胞的表面抗原特征，純度高，活性高及多向分化潛能，完全符合大鼠BMSCs的生物學(xué)特性。
　　2、注射鹽酸阿霉素14d后，綜合各項(xiàng)結(jié)果判定本方法大鼠阿霉素腎病模型建立成功，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　3、①干預(yù)后4w，MSC組、強(qiáng)的松組與模型組相比，腎臟組織中足細(xì)胞足突融合及微絨毛變性明顯減少，MSC對(duì)阿霉素所造成的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞起到一定的保護(hù)作用。② MSC輸注后，MSC組中24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮、

6、膽固醇、甘油三酯和白蛋白與模型組相比得到很大程度的改善，大鼠的腎臟功能得到了保護(hù)，尤其是24h尿蛋白定量減少明顯。③干預(yù)后2w,MSC組和強(qiáng)的松組中血清中MCP-1表達(dá)相對(duì)于模型組明顯下降，干預(yù)后4w和8w，MSC控制炎癥能力有所下降，但相對(duì)于模型組血清中MCP-1表達(dá)仍然是降低的。④干預(yù)后4w，MSC組、強(qiáng)的松組與模型組相比，腎皮質(zhì)中synaptopodin和p21 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。⑤干預(yù)后4w，Western blot表明MS

7、C組、強(qiáng)的松組與模型組比較synaptopodin和p21蛋白的表達(dá)得到上調(diào)。
　　結(jié)論：1、通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法能夠成功從大鼠骨髓中分離出高純度、高活性的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、經(jīng)尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素能夠成功建立大鼠阿霉素腎病模型。
　　3、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MSC保護(hù)阿霉素腎病大鼠的機(jī)制之一是：MSC的輸注抑制了腎組織內(nèi)MCP-1的產(chǎn)生，減輕了腎組織的炎癥損傷，通過