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1、目的:1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymalstemcells,BMSCs)的分離及培養(yǎng),并鑒定其相關(guān)生物學(xué)特性;
2、建立阿霉素腎病大鼠模型;
3、檢測(cè)生化指標(biāo),電鏡觀察,應(yīng)用普通PCR和Western blot技術(shù)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素腎病大鼠的干預(yù)作用及mTOR的表達(dá)。
方法:1、提取、培養(yǎng)與鑒定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞---通過大鼠淋巴細(xì)胞分離液得到單個(gè)核細(xì)胞層
2、,再通過密度梯度離心法和貼壁篩選法,不斷傳代、擴(kuò)增,并通過流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物質(zhì)、同時(shí)運(yùn)用成骨及成脂誘導(dǎo)方法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性;
2、大鼠阿霉素腎病模型建立---非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素,14天后,綜合各項(xiàng)結(jié)果:一般表現(xiàn),24h尿蛋白定量、肌酐等各項(xiàng)生化指標(biāo),結(jié)合腎臟組織HE染色及電鏡觀察大鼠阿霉素腎病模型;
3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素腎病大鼠的干預(yù)作用及mTOR
3、的表達(dá)---實(shí)驗(yàn)分組:模型組;MSC組;正常對(duì)照組;應(yīng)用普通PCR和western blot技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTO R不同時(shí)間點(diǎn)mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。
結(jié)果:1、大鼠BMSCs細(xì)胞易于分離、培養(yǎng),而且具有間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原特征,純度高,活性高及多向分化潛能;
2、注射鹽酸阿霉素14天后,綜合各項(xiàng)結(jié)果判定本方法建立大鼠阿霉素腎病模型成功,可以實(shí)驗(yàn);
4、 3、干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn),PCR檢測(cè)模型組nephrinmRNA表達(dá)量均下降,隨時(shí)間推移下降越明顯,干細(xì)胞干預(yù)后nephrinmRNA表達(dá)量出現(xiàn)上升(較模型組),但相對(duì)于正常組仍然下降,Western blot檢測(cè)nephrin同上。干預(yù)后1周及3周,Western blot表明模型組mTOR條帶稍微增粗,p-mTOR條帶模型組也增粗,且經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)后條帶變窄,但相對(duì)正常組仍然變寬?;叶戎党霈F(xiàn)相應(yīng)變化,干預(yù)后2w,Western blot表
5、明模型組mTOR條帶稍微增粗,p-mTOR條帶模型組增粗較明顯,且經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)后條帶變窄窄,但相對(duì)正常組仍然變寬?;叶戎党霈F(xiàn)相應(yīng)變化.
結(jié)論:1、可以通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法,成功地從大鼠骨髓中分離出高純度、高活性和具有多向分化潛能的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;
2、可以經(jīng)尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素,建立大鼠阿霉素腎病模型,時(shí)間為14天;
3、MSC保護(hù)阿霉素腎病大鼠的可能機(jī)制是:M
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