降解CSPGs對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠視網(wǎng)膜變性的作用.pdf

1、視網(wǎng)膜變性是一類難治性疾病，其中最常見的有年齡相關(guān)性黃斑變性(age relatedmacular degeneration，AMD)，視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)等，全世界有數(shù)百萬人因此永久致盲，危害性極大。因視網(wǎng)膜屬于終末神經(jīng)組織，神經(jīng)細(xì)胞再生困難，此類疾病的治療非常棘手。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有多向分化潛能的

2、成體干細(xì)胞，可分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞，可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，可分泌多種具有營養(yǎng)功能的細(xì)胞因子。但是BMSCs在視網(wǎng)膜下腔移植后，大部分細(xì)胞主要集中在注射區(qū)域，難以遷移、整合入視網(wǎng)膜，從而限制了BMSCs在病變視網(wǎng)膜上發(fā)揮其修復(fù)作用。
　　 有研究證實，膠質(zhì)細(xì)胞和硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)是Müller細(xì)胞移植入RCS大鼠視網(wǎng)膜的障礙，用硫酸軟骨素

3、酶(chondroitinaseABC，ChABC)降解CSPGs后可促使Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜上大量移行。那么，BMSCs在變性視網(wǎng)膜內(nèi)遷移困難的原因可能也和視網(wǎng)膜上CSPGs形成的屏障有關(guān)。本實驗擬將ChABC處理的BMSCs移植到視網(wǎng)膜變性大鼠視網(wǎng)膜下腔，觀察ChABC降解CSPGs后BMSCs在視網(wǎng)膜上的遷移情況，以及對視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響，從而尋找提高BMSCs移植治療視網(wǎng)膜變性療效的途徑。
　　 研究目的:

4、　　 建立碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性大鼠的動物模型。建立體外分離、培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。視網(wǎng)膜下腔注射硫酸軟骨素酶處理的BMSCs，探討降解CSPGs對于BMSCs治療視網(wǎng)膜色素變性的作用。
　　 研究方法:
　　 1、4周齡的SD大鼠40只行腹腔注射碘酸鈉(NaIO3，3％，100mg/kg)，注射后14d、28d、90d、180d后分別處死動物取眼球行視網(wǎng)膜HE染色。體外分離SD大鼠骨髓細(xì)胞，密

5、度梯度離心法培養(yǎng)BMSCs，分別行流式細(xì)胞儀及成骨、成脂鑒定，BrdU標(biāo)記BMSCs。
　　 2、造視網(wǎng)膜色素變性模型，分為A組不干預(yù)組，B組BMSCs注射組，C組BMSCs+ChABC注射組，D組PBS注射組。28d后將硫酸軟骨素酶(chondroitinaseABC，ChABC)處理或未處理的BMSCs注射入大鼠視網(wǎng)膜下腔，14d后處死大鼠并取出眼球，行視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、免疫熒光、免疫組化檢測。
　　 實驗結(jié)果:

6、>　　 1、大鼠腹腔注射NaIO3后RPE細(xì)胞變形、萎縮，視桿視錐層結(jié)構(gòu)紊亂，外核層呈波浪狀改變，光感受器細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。BMSCs在體外快速增殖、傳代，P3代后細(xì)胞CD34、CD45陰性，CD44、CD90陽性的百分率始終高于95％，并能進(jìn)行成脂、成骨分化，用BrdU標(biāo)記BMSCs的標(biāo)記率可達(dá)90％以上。
　　 2、(1)免疫熒光顯示:B組BMSCs注射組BrdU標(biāo)記發(fā)綠色熒光的BMSCs主要分布于視網(wǎng)膜下腔，僅少量BMS

7、Cs遷移至外核層以內(nèi)的視網(wǎng)膜，細(xì)胞遷移率為（7.2±3.71）％，C組BMSCs+ ChABC注射組BrdU標(biāo)記發(fā)綠色熒光的BMSCs大部分遷移至視網(wǎng)膜外核層，細(xì)胞遷移率為（68.6±6.09）％。B組與C組的BMSCs遷移率相比，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.01)。(2)視網(wǎng)膜下腔注射BMSCs14d后視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡率:A組不干預(yù)組（41.7±2.75）％，B組BMSCs注射組（34.4±3.44）％，C組BMSCs+ ChABC

8、注射組（32.2±3.08）％，D組PBS注射組(40.9±2.96)％，B組、C組與A組、D組分別進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)免疫組化顯示，BMSCs在眼內(nèi)表達(dá)抗原GFAP。
　　 結(jié)論:
　　 1、腹腔注射碘酸鈉可成功建立視網(wǎng)膜變性動物模型，密度梯度離心法培養(yǎng)BMSCs時間短、效率高，BrdU可作為BMSCs的合適標(biāo)記物。
　　 2、降解CSPGs可以提高BMSCs在視網(wǎng)膜上的遷移能力