骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對光損傷視網(wǎng)膜的保護(hù)作用與機(jī)制.pdf

1、隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)認(rèn)識的深入,MSCs的定義已經(jīng)超出了作為一種具有多向分化潛能成體干細(xì)胞的概念。MSCs被認(rèn)為是多源的細(xì)胞群體,廣泛參與了組織修復(fù)。MSCs可能通過細(xì)胞因子分泌和調(diào)節(jié)機(jī)體微環(huán)境促進(jìn)損傷修復(fù)過程,然而其確切的機(jī)制尚不清楚。本研究采用體外模型探討視網(wǎng)膜光損傷對MSCs細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響,并進(jìn)一步闡述細(xì)胞因子表達(dá)變化在MSCs參與視網(wǎng)膜變性過程的作用。通過體內(nèi)移植研

2、究MSCs在視網(wǎng)膜光損傷中的作用及移植介導(dǎo)的宿主細(xì)胞因子表達(dá)變化。
　　第一部分:視網(wǎng)膜光損傷動物模型研究
　　目的:建立視網(wǎng)膜光損傷動物模型,探討光損傷對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響及光損傷誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞因子表達(dá)變化。
　　方法:6~8WSD大鼠經(jīng)散瞳后,進(jìn)行12h光照(5klux),12h避光,每日反復(fù)。并于強(qiáng)光暴露后1d、2d、5d、7d、14d摘除眼球。采用透射電鏡觀察光照早期視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變。HE染色觀察強(qiáng)光暴

3、露對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響。末端脫氧核苷酸標(biāo)記法(TUNEL)檢測光照后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。采用墨汁灌注及視網(wǎng)膜鋪片法評估光照后視網(wǎng)膜微循環(huán)通透性改變。免疫熒光檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞因子bFGF、BDNF、CNTF的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:強(qiáng)光暴露24h后,視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變,光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤大量脫落,線粒體膜腫脹,核電子密度增高。視網(wǎng)膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)隨光照時(shí)間的延長而持續(xù)破壞,視網(wǎng)膜外核層進(jìn)行性變薄。視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡于光照后持續(xù)存在,主要

4、分布于外核層及視網(wǎng)膜色素上皮層。強(qiáng)光暴露視網(wǎng)膜微血管通透性增強(qiáng),墨汁灌注出現(xiàn)點(diǎn)狀滲出,光照14d后出現(xiàn)片狀滲漏,位于深層。強(qiáng)光暴露引起視網(wǎng)膜bFGF、BDNF、CNTF及GFAP表達(dá)上調(diào)。其中CNTF及GFAP表達(dá)上調(diào)隨光照時(shí)間延長而增強(qiáng)。
　　結(jié)論:強(qiáng)光暴露可以引起視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)破壞并出現(xiàn)反應(yīng)性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào),視網(wǎng)膜光損傷伴隨膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)。
　　第二部分:視網(wǎng)膜光損傷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)功能的影響
　　目

5、的:探討光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液對MSCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響及細(xì)胞因子表達(dá)變化在MSCs參與視網(wǎng)膜變性過程的作用。
　　方法:全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs,并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、成骨及成脂分化鑒定。制備正常及光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液,分別誘導(dǎo)第3~5代MSCs2d及5d。采用RT-qPCR及Western-blotting檢測bFGF、BDNF、CNTF表達(dá)情況并與未誘導(dǎo)組MSCs比較。收集未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后MSCs培養(yǎng)上清液,制備條件培養(yǎng)液,培

6、養(yǎng)視網(wǎng)膜片24h。收集視網(wǎng)膜片培養(yǎng)液,通過LDH釋放水平評估不同條件培養(yǎng)液對視網(wǎng)膜細(xì)胞膜完整性的影響。RT-qPCR檢測不同條件培養(yǎng)液對視網(wǎng)膜bcl-2及bax表達(dá)的影響。構(gòu)建含bFGF干擾序列的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染MSCs并進(jìn)一步誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的MSCs,觀察bFGF表達(dá)下調(diào)對MSCs發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用的影響。
　　結(jié)果:MSCs可以表達(dá)bFGF、BDNF、CNTF。經(jīng)光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導(dǎo)后,MSCs表達(dá)bFGF及CNTF顯著

7、增強(qiáng)(P<0.05)。MSCs條件培養(yǎng)液上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達(dá),抑制bax表達(dá)及LDH釋放。光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導(dǎo)后的MSCs條件培養(yǎng)液較其它條件培養(yǎng)液顯著提高其上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達(dá),抑制bax表達(dá)及LDH釋放的能力(均P<0.05)。bFGF表達(dá)下調(diào)后的MSCs條件培養(yǎng)液仍可上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達(dá),抑制LDH釋放。但各條件培養(yǎng)液組間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:損傷刺激可以促進(jìn)MSCs細(xì)胞因子表

8、達(dá),增強(qiáng)MSCs的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用,損傷誘導(dǎo)的bFGF表達(dá)上調(diào)在MSCs應(yīng)對視網(wǎng)膜變性中具有重要作用。
　　第三部分:經(jīng)靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對光損傷視網(wǎng)膜的影響
　　目的:探討MSCs靜脈移植對光損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響及移植后細(xì)胞遷移和移植介導(dǎo)的宿主細(xì)胞因子表達(dá)變化。
　　方法:建立視網(wǎng)膜光損傷動物模型,MSCs注射組于強(qiáng)光暴露48h后,經(jīng)靜脈移植MSCs,劑量5×106個(gè)/ml,DMEM注射組接受等體積的DM

9、EM注射。采用TUNEL比較光照14d后單純光照組、DMEM注射組及MSCs注射組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況,HE染色比較各組視網(wǎng)膜外核層厚度變化情況,Western-blotting檢測光照1d、2d、5d、7d、14d各組視網(wǎng)膜CNTF及GFAP的表達(dá)情況。免疫熒光雙重標(biāo)記檢測CNTF與GFAP的定位情況。采用GFP標(biāo)記的MSCs靜脈移植觀察移植后細(xì)胞在視網(wǎng)膜的橫向及縱向分布情況。
　　結(jié)果:經(jīng)靜脈移植的MSCs可以移行并遷移出視網(wǎng)膜