骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對阿霉素?fù)p傷足細(xì)胞mTOR的影響.pdf

1、目的：
　　探討大鼠BMSCs對阿霉素?fù)p傷足細(xì)胞mTOR的影響。
　　方法：
　　1、利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離法從SD大鼠骨髓中提取BMSCs，經(jīng)體外傳代、擴增至P3，并利用流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90，同時運用成軟骨和成脂誘導(dǎo)方法鑒定其功能。
　　2、利用過篩法和IV型膠原酶消化法從SD大鼠腎臟中提取足細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)，并通過免疫熒光法檢測其表面特有的蛋白nephrin

2、和podocin對其進(jìn)行鑒定。
　　3、體外實驗，分為：正常組足細(xì)胞；阿霉素組足細(xì)胞+阿霉素(2ug/ml)；干細(xì)胞組足細(xì)胞+BMSCs（共培養(yǎng)24h）+阿霉素(2ug/ml)。各實驗組干預(yù)0h、3h、24h后利用Western bolt技術(shù)檢測各組足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白nephrin及mTOR信號通路相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、raptor、rictor的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形、

3、多角形成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，大小基本一致。BMSCs在分別加入成軟骨和成脂誘導(dǎo)劑下成功誘導(dǎo)出成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面的抗原標(biāo)志物提示CD29、CD90呈強陽性，CD34和CD45呈陰性表達(dá)。細(xì)胞純度可達(dá)98％以上。
　　2、利用過篩法可以成功分離出腎小球，用IV型膠原酶消化后種植在培養(yǎng)瓶中能從腎小球中爬出成鵝卵石樣細(xì)胞，利用免疫熒光法檢測其表面可以表達(dá)出足細(xì)胞特有的蛋白nephrin和podocin。

4、r>　　3、Western bolt結(jié)果顯示：在0小時和3小時時，正常組、阿霉素組、干細(xì)胞組nephrin和rictor的表達(dá)無明顯差異;在24小時時，干細(xì)胞組和阿霉素組的nephrin的表達(dá)均比正常組少，但干細(xì)胞組比阿霉素組的表達(dá)多，同時干細(xì)胞組和阿霉素組的rictor的表達(dá)均比正常組多，但干細(xì)胞組比阿霉素組的表達(dá)少。mTOR、p-mTOR、raptor蛋白在0小時時，正常組、阿霉素組、干細(xì)胞組的表達(dá)無明顯差異，但是在3小時、24小時

5、時，干細(xì)胞組和阿霉素組的表達(dá)均比正常組多，但干細(xì)胞組比阿霉素組的表達(dá)少，且24小時時的表達(dá)量均大于3小時時的表達(dá)量。
　　結(jié)論：
　　1、利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法能成功提取、培養(yǎng)出BMSCs，并且其純度高、活性高、增殖能力強及多向分化潛能，可用于實驗研究。
　　2、利用過篩法和IV型膠原酶消化法能成功提取、培養(yǎng)出符合實驗要求的足細(xì)胞。
　　3、AMD足細(xì)胞的損傷機制與足細(xì)胞mTOR過度激活有關(guān)，從而導(dǎo)致足