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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:研究胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞(metanephric mesenchymal cells,MMCs)尾靜脈移植對(duì)阿霉素(Adriamycin,ADR)慢性腎病大鼠損傷腎臟的再生修復(fù)作用及其可能機(jī)制。 方法: 1.大鼠胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。取孕13天大鼠胚胎,分離胚胎腎臟,去除輸尿管芽,消化后置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞,并行HE染色、電鏡觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定;A
2、BC免疫酶染色法檢測(cè)波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34;直接免疫熒光法檢測(cè)雙花扁豆凝集素(Dolichos Biflorus,DB),并流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。 2.大鼠胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞的體外標(biāo)記方法探討。分別將4’,6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、DAPI體外標(biāo)記MMCs、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)
3、體外標(biāo)記MMCs,通過(guò)尾靜脈注入阿霉素腎病大鼠體內(nèi);于細(xì)胞移植后1w、3w、5w行腎組織冰凍切片,觀察DAPI及GFP熒光分布,并ABC免疫酶染色法檢測(cè)腎組織中GFP表達(dá)。 3.從細(xì)胞分化的角度,探討尾靜脈細(xì)胞移植對(duì)阿霉素腎病大鼠的修復(fù)改善作用。(1)分別以含阿霉素腎病大鼠血清及腎組織勻漿的培養(yǎng)基,體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后腎間充質(zhì)細(xì)胞,采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)、角蛋白-18(cytokeratin
4、-18,CK-18)、波形蛋白、維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)表達(dá)。(2)通過(guò)尾靜脈注射移植GFP標(biāo)記MMCs至阿霉素腎病大鼠,CK及GFP雙標(biāo)記觀察MMCs的歸巢及分化情況。(3)檢測(cè)阿霉素大鼠細(xì)胞移植前后24小時(shí)尿蛋白定量、24小時(shí)尿肌酐定量、血清白蛋白、總膽固醇、尿素氮、肌酐、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積等指標(biāo),并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率,了解MMCs對(duì)腎功能的影響。 4.探討胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞移
5、植對(duì)阿霉素腎病大鼠的治療作用。90只體重200~220.Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成3組:阿霉素腎病組(ADR group,n=40):采用阿霉素二次注射法,間隔3周,每次劑量為0.25 mg/10.g體重;MMCs細(xì)胞移植組(ADR-MMCs group,n=40):于第二次阿霉素注射后8周,尾靜脈注入MMCs,劑量為每只大鼠5~7×106;正常對(duì)照組(control group,n=10)。于阿霉素注射后16周殺鼠,留取
6、標(biāo)本行血、尿生化檢測(cè)、腎組織病理學(xué)分析,免疫組化法檢測(cè)腎組織IV型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,NMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表達(dá),并Western blot及RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)腎組織MMP-2、MMP-9的蛋白及基因定量。 結(jié)果: 1.MMCs形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng),48~72小時(shí)達(dá)生
7、長(zhǎng)高峰;波形蛋白、nestin、CD133表達(dá)陽(yáng)性;角蛋白、CD34、DB表達(dá)陰性;MMCs以DB標(biāo)記后流式細(xì)胞檢測(cè)為單峰。 2.(1)DAPI標(biāo)記細(xì)胞及單純DAPI尾靜脈注射后1周,均可在腎小管上皮細(xì)胞中觀察到DAPI陽(yáng)性細(xì)胞,至移植后5周仍可觀察到,但隨時(shí)間延長(zhǎng)熒光有減弱趨勢(shì)。(2)GFP標(biāo)記細(xì)胞移植后1周,可在腎小管上皮細(xì)胞中觀察到GFP陽(yáng)性細(xì)胞,至移植后5周仍可觀察到,熒光無(wú)明顯減弱。(3)ABC免疫酶染色法檢測(cè),顯示G
8、FP陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)于近端腎小管中,腎小球系膜區(qū)亦可觀察到少量表達(dá);GFP陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)于胞漿。GFP表達(dá)半定量評(píng)分顯示,標(biāo)記細(xì)胞的早期應(yīng)用陽(yáng)性率大于晚期應(yīng)用者,且隨觀察時(shí)間延長(zhǎng),陽(yáng)性率有升高趨勢(shì)。 3.(1)MMCs在阿霉素腎病大鼠血清及勻漿體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下,均可檢測(cè)到CK-18、VDR陽(yáng)性表達(dá)。(2)GFP標(biāo)記MMCs移植后1周,于阿霉素腎病大鼠腎小管及腎小球中,均可檢測(cè)到GFP、CK雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。(3)阿霉素腎病大鼠MM
9、Cs移植后,內(nèi)生肌酐清除率提高,但其它指標(biāo)檢測(cè)(24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積)與細(xì)胞移植前比較,均無(wú)顯著性差異。另外,血尿素氮、肌酐在阿霉素作用前后無(wú)顯著性差異。 4.與阿霉素組比較,細(xì)胞移植組大鼠腎組織IV型膠原沉積減少、MMP-2蛋白表達(dá)下調(diào)、MMP-9蛋白表達(dá)升高,并有顯著性差異(P<0.05);相關(guān)分析顯示,IV型膠原沉積與MMP-2蛋白表達(dá)存在正相關(guān),而與MMP-9蛋白表達(dá)呈
10、負(fù)相關(guān)(P<0.05);血、尿生化指標(biāo)檢測(cè)同第三部分類(lèi)似,細(xì)胞移植組與阿霉素組在24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積檢測(cè)上,均無(wú)顯著性差異。另外,血尿素氮、肌酐在大鼠阿霉素作用前后無(wú)顯著性差異。 結(jié)論: 1.培養(yǎng)細(xì)胞為后腎間充質(zhì)細(xì)胞,純度及穩(wěn)定性較高并符合干細(xì)胞特征。 2.MMCs的脂質(zhì)體感染法GFP標(biāo)記,是一便捷、有效的體外標(biāo)記方法,適于移植細(xì)胞的短期內(nèi)示蹤、觀察,并可為其它
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