骨髓間充質干細胞對大鼠腦出血后血腦屏障的保護作用及機制研究.pdf

1、腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是常見的腦血管病之一，也是一種對人類健康有著嚴重危害的疾病，它的發(fā)病率、致殘率以及死亡率都比較高。
　　骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，是擁有多向分化潛能并且能進行自我復制的成體干細胞。它主要來源于骨髓組織，能夠進行自我更新，具有分化為骨細胞、心肌細胞、肝細胞和膠質細胞等的潛能。MSCs具有相對其它細胞來說更容

2、易獲取的渠道，也具有分離后容易傳代培養(yǎng)的特點。而正是基于BMSCs擁有的這些優(yōu)點使得它們成為研究許多疾病治療的理想種子細胞，其中就包括應用在腦出血疾病中的治療研究。以往的研究表明MSCs能夠通過遷移到損傷部位增加內源性細胞增殖和促進血管生成等作用，達到對腦出血的治療效果。但是近年來的一些研究表明，通過分泌多種細胞營養(yǎng)因子、生長因子及多種黏附分子等旁分泌作用，可能是MSCs發(fā)揮治療效果的主要機制。
　　隨著研究的增多和深入，MSCs

3、旁分泌作用越來越引起人們的關注。在一些組織創(chuàng)傷模型試驗中，通過研究已經明確了MSCs的旁分泌作用對于促進組織創(chuàng)傷的愈合和功能的恢復具有治療效果，其中包括心肌梗死、急性腎小管損傷、角膜損傷、肝功能損傷和顱腦外傷等實驗模型。通過MSCs的旁分泌作用，可以抑制細胞的凋亡、促進創(chuàng)傷組織細胞的分化、誘導血管新生和減輕炎癥反應等達到治療效果。有研究發(fā)現MSCs能通過旁分泌作用促進心梗邊緣區(qū)新生微血管的形成;也有研究發(fā)現通過MSCs的旁分泌作用促進腦

4、梗塞疾病中梗死半暗區(qū)得到營養(yǎng)支持、抑制細胞凋亡和促進新生血管的形成;另外在MSCs的旁分泌作用下通過抗炎和免疫調節(jié)機制達到對腦損傷的相關研究也獲得了證實。總而言之，目前已經有不少研究已經發(fā)現MSCs通過旁分泌機制在許多疾病中都能達到治療效果。
　　大量研究發(fā)現，MSCs移植能夠通過促進神經細胞增殖分化、減少細胞凋亡和一定程度上減輕炎癥反應達到對腦出血的治療效果。盡管有一些實驗已經通過研究發(fā)現MSCs能夠通過旁分泌機制分泌一些可溶性

5、因子，例如白細胞介素10(IL-10)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase)和前列腺素E2(prostaglandin E2)發(fā)揮生物學特性，而且近年來一種叫腫瘤壞死因子誘導蛋白6(TNF-stimulated gene6 protein，TSG-6)的抗炎因子在MSCs發(fā)揮作用的過程中引起越來越多的重視，但是MSCs移植能否通過旁分泌機制，減輕腦出血后BBB的破壞進而減輕腦水腫的程度，最終達到

6、對腦出血治療的研究卻尚未見到報道。所以，本實驗使用SD大鼠的腦出血模型，通過靜脈移植MSCs來研究它對大鼠腦出血后血腦屏障和腦水腫的影響，探究其中可能涉及的機制，為更加全面地理解MSCs移植治療腦出血提供更加深刻的研究基礎。
　　第一章:大鼠骨髓MSCs收集、培養(yǎng)及細胞鑒定
　　目的:
　　從SD大鼠股骨和脛骨分離細胞后利用全骨髓貼壁法對骨髓MSCs進行培養(yǎng)最終獲取作為干細胞移植的理想種子。
　　方法:
　

7、　取5周大小的SD大鼠，取其股骨和脛骨，以1×106cells/25cm2密度接種骨髓細胞，當細胞生長至大約90％融合時消化貼壁細胞進行傳代，取第3代MSCs用于本實驗的研究，通過流式細胞儀對獲取的MSCs進行細胞表型鑒定，相關的表型包括CD29、CD34、CD44、CD45和CD90。
　　結果:
　　通過流式細胞儀檢測第3代MSCs結果為，CD29:99.52％，CD44:94.63％, CD90:99.65％; CD3

8、4:1.61％, CD45:0.95％。CD29、CD44和CD90為高表達，CD34和CD45為低表達。
　　結論:
　　本實驗通過全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法，獲得了純度較高和生物學特性較穩(wěn)定的MSCs。相關的細胞表型也符合國際上對MSCs的標準。所以我們獲取的MSCs可以作為合適的種子用于本實驗的干細胞移植治療的研究。
　　第二章:BMSCs對大鼠腦出血后BBB破壞的保護作用
　　目的:
　　建立大鼠的腦出血

9、模型，在不同的時間點檢測與BBB破壞密切相關的物質，包括iNOS、ONOO-、MMP-9、緊密連接蛋白claudin-5和ZO-1等的表達，以及給予MSCs治療后這些物質與神經功能的變化情況，從而為MSCs應用于臨床腦出血的治療提供新的參考依據。
　　方法:
　　本研究中，我們通過使用注射Ⅳ型膠原酶來建立大鼠腦出血的模型。SD大鼠被隨機分為假手術組、PBS模型組（腦出血+PBS組）、MSCs移植治療組（腦出血+MSCs組）。

10、模型組與假手術組造模過程基本一樣，唯一不同的是模型組是用10-uL的微量注射器在右側紋狀體注射含有0.5IU的Ⅳ型膠原酶2uL，而假手術組是將微量注射器刺入右側紋狀體而不注射Ⅳ型膠原酶。在大鼠腦出血造模后2h，MSCs移植治療組通過靜脈系統(tǒng)將經鑒定合格的濃度為5×106個/ul的200ul細胞緩慢注入，而腦出血模型組則是注射等量的200ul磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)。我們通過免疫組織化學技

11、術來確定Iba-1+小膠質細胞/巨噬細胞和MPO+嗜中性粒細胞的密度;通過TUNEL法檢測細胞凋亡;通過ELISA法檢測與炎癥相關的細胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-10、tumor necrosisfactor(TNF)-α、interferon(IFN)-γ和transforming growth factor(TGF)-β1;通過免疫熒光技術檢測與BBB破壞程度密切相關的ZO-1、iNOS和3-NT;通過WesternBl

12、ot方法檢測相應蛋白表達變化，其中包括ZO-1、Claudin-5、iNOS、3-NT和MMP-9，而這些蛋白與BBB的通透性有著緊密的聯(lián)系。
　　結果:
　　通過免疫組織化學技術法發(fā)現，在術后第3天PBS模型組較假手術組的Iba-1+小膠質細胞/巨噬細胞和MPO+嗜中性粒細胞在密度上明顯增加，而MSCs移植治療組有效地減少它們在模型組中的增加。在ELISA法檢測中發(fā)現，術后第1、3和7天，與炎癥相關的細胞因子也是在MSCs

13、治療后明顯降低。免疫熒光檢測結果提示在術后第3天，MSCs移植治療組能有效增加在PBS模型組中降低的ZO-1表達量，同時降低在模型組中升高的iNOS和3-NT表達量。經過Western Blot檢測同樣可見，與PBS模型組中升高的iNOS、3-NT和MMP-9相比，MSCs移植治療組在有效地降低了這幾種與BBB破壞性密切相關的蛋白表達量的同時卻增加了ZO-1和Claudin-5這些緊密連接蛋白的表達。
　　結論:
　　腦出血

14、后相關產物的形成，對BBB的正常結構產生破壞從而增加其通透性并加重腦水腫的程度，如iNOS、3-NT和MMP-9等產物對腦血管內皮細胞緊密連接蛋白claudin-5/ZO-1產生的破壞作用。通過靜脈移植MSCs能夠有效地減少上述產物的表達量從而減輕BBB的破壞程度。
　　第三章:BMSCs對大鼠腦出血后BBB保護作用的機制研究
　　目的:
　　目前一些研究發(fā)現MSCs移植能夠對腦出血有一定的治療效果，但是主要的機制主要

15、是與促進神經細胞分化和誘導血管新生等相關，很少有關于MSCs作用于腦出血后BBB通透性方面的研究，而BBB通透性恰恰與腦出血后腦水腫的發(fā)生密切相關。所以我們通過建立腦出血模型，使用靜脈系統(tǒng)移植MSCs來研究它對腦出血后BBB通透性影響的機制。
　　方法:
　　造模和分組與第二章“BMSCs對大鼠腦出血后BBB破壞的保護作用”采用的方法一樣，通過Ⅳ型膠原酶建立大鼠腦出血的模型，并將SD大鼠隨機分為假手術組、PBS腦出血模型組、

16、MSCs移植治療組。通過mNSS評分系統(tǒng)，評估腦出血后1和3天大鼠的神經運動功能情況。用腦水含量和伊文斯蘭(Evan，sblue，EB)檢測的方法，評估腦出血后1和3天大鼠的腦水腫和BBB破壞程度。通過RT-PCR技術檢測免疫抑制相關抗炎因子TSG-6的表達情況，而WesternBlot技術除TSG-6之外，也對NF-κB信號通路進行檢測。
　　結果:
　　通過mNSS評分系統(tǒng)和對大鼠腦水含量以及EB檢測的方法，我們發(fā)現:與

17、假手術組相比，在腦出血后的1和3天，PBS模型組的大鼠mNSS評分升高，BBB通透性以及腦水腫的程度明顯增加。而在MSCs治療組，mNSS評分得到下降，BBB通透性和腦水腫的程度也有不同程度的改善。不管是RT-PCR還是WesternBlot技術都發(fā)現，相對假手術組和PBS模型組，TSG-6的表達量在MSCs治療組顯著增加，而通過Western Blot對NF-κB信號通路的檢測發(fā)現，MSCs能夠抑制IκBs在模型組降低的趨勢，相反卻能