低氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胰島移植是治療Ⅰ型糖尿病的重要手段。但是在移植的早期由于各種非免疫性的因素的作用,大約有50％的胰島細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。在胰島細(xì)胞的分離、提取過(guò)程中,大量的胰島外周毛細(xì)血管被破壞,使得胰島細(xì)胞在分離、保存及移植的早期處于嚴(yán)重的低氧狀態(tài)。而胰島細(xì)胞本身對(duì)于氧分壓十分敏感,因此低氧可能是導(dǎo)致早期移植物丟失的主要原因。間充質(zhì)干細(xì)胞由于具有組織修復(fù)和支持功能因而被廣泛應(yīng)用于胰島移植。大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)分泌大量保護(hù)

2、性生長(zhǎng)因子減輕炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng),加快血管新生,促進(jìn)移植物的存活。但是目前對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)胰島細(xì)胞方式(直接或是間接)尚不明確,其具體機(jī)制研究較少。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)利用體外直接接觸和間接接觸(transwell小室模型)的培養(yǎng)方法和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討了低氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)胰島細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1、取 F344大鼠股骨,反復(fù)沖洗得到骨髓內(nèi)的細(xì)胞,經(jīng)反復(fù)貼壁離心,傳代至3-6代得到實(shí)驗(yàn)

3、用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀,ELISA,von kossa和油紅O染色對(duì)獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記物及功能進(jìn)行鑒定。通過(guò)逆行經(jīng)膽管灌注酶解法,histopaque1077密度梯度離心法提取大鼠F344的胰島細(xì)胞,行ELISA檢測(cè)功能。
　　2、將間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島細(xì)胞在低氧條件下共培養(yǎng)24h,實(shí)驗(yàn)分組:單獨(dú)胰島組,直接接觸共培養(yǎng)組和間接接觸共培養(yǎng)組(transwell小室將兩者分離),另設(shè)置常氧下胰島組作為對(duì)照。

4、利用ELISA檢測(cè)胰島細(xì)胞的分泌功能,TUNEL和流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡和壞死情況。
　　3、將提取得到的F344大鼠的胰島與間充質(zhì)干細(xì)胞移植入裸小鼠左腎被膜下。實(shí)驗(yàn)分組單獨(dú)胰島組(胰島細(xì)胞移植入左腎下極被膜,以血凝塊封堵),直接接觸組(預(yù)先將間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島細(xì)胞混合后移植入左腎被下極被膜,以血凝塊封堵),間接接觸組(將胰島細(xì)胞移植入左腎下極被膜,將間充質(zhì)干細(xì)胞移植入左腎上極被膜,以血凝塊封堵隔離),另有單獨(dú)移植間充質(zhì)干

5、細(xì)胞于左腎上極的對(duì)照組。移植后定期檢測(cè)血糖水平21天。為進(jìn)一步研究間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于早期移植物的保護(hù)作用機(jī)制,相同的實(shí)驗(yàn)分組,于移植后48小時(shí)取移植腎臟,行免疫熒光化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。
　　4、將GFP標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島細(xì)胞系INS-1在低氧條件下共培養(yǎng)24h,實(shí)驗(yàn)分組:單獨(dú)胰島組,直接接觸共培養(yǎng)組和間接接觸共培養(yǎng)組(transwell小室將兩者分離),另設(shè)置常氧下胰島組作為對(duì)照。通過(guò)免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色,weste

6、rn blot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)反復(fù)貼壁離心法,得到間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)記物的鑒定,干細(xì)胞表面CD29、CD105、CD90高表達(dá),而低表達(dá)造血細(xì)胞的標(biāo)記物如 CD34、CD45、 CD80;ELISA檢測(cè)分泌IGF-1,HGF,VEGF;具有成骨、成脂多向分化能力。光鏡下觀察胰島細(xì)胞的形態(tài)并計(jì)數(shù),ELISA的結(jié)果提示胰島分泌功能良好。
　　2、ELISA

7、結(jié)果提示:間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)直接接觸的方式保護(hù)低氧條件下胰島細(xì)胞的分泌功能,而間接接觸保護(hù)作用并不明顯。TUNEL和流式細(xì)胞結(jié)果提示:間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)直接接觸的方式提高低氧條件下的胰島細(xì)胞的存活。
　　3、將間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島細(xì)胞以直接接觸的方式進(jìn)行移植,可以明顯改善胰島移植物功能,提高移植效率。免疫熒光結(jié)果提示:直接接觸組中,間充質(zhì)干細(xì)胞能夠保護(hù)移植早期胰島細(xì)胞內(nèi)PDX-1的表達(dá)。
　　4、免疫熒光染色、wester

8、n blot及實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果提示間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)直接接觸的方式抑制低氧條件胰島細(xì)胞內(nèi)NF-κB及其下游靶基因的活化,進(jìn)而上調(diào)胰島素上游調(diào)控基因PDX-1和Mafa的表達(dá)。細(xì)胞間的粘附蛋白E-cadherin可能參與了此過(guò)程。
　　結(jié)論：
　　間充質(zhì)干細(xì)胞能夠以直接接觸的方式保護(hù)低氧條件下胰島細(xì)胞的功能并提高胰島細(xì)胞存活率。其機(jī)制可能是間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)直接接觸的方式抑制低氧條件下胰島細(xì)胞的NF-κB及其下游靶基因的活