2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的: 系統(tǒng)性硬皮病(systemicscleroderma,SSc)是一種以局限性或彌漫性皮膚及內臟器官的纖維化為特征的結締組織病。目前其確切病因及發(fā)病機制仍未明確,亦無切實有效的治療手段,探討本病的發(fā)病機理,尋找有效的治療藥物和方法有非常重要的意義。 SSc是一種自身免疫性疾病,以皮膚和組織器官纖維化、硬化為特征,其在早期病變時,患者已有顯著的細胞免疫和體液免疫異常:包括T淋巴細胞亞群的分布異常,局部單核細

2、胞浸潤,多種自身抗體的產生等。而膠原合成過多,分解減少,大量膠原纖維在皮膚、肺、腎、消化道等組織器官的沉積是其主要病理過程之一。人體合成膠原的最主要場所是成纖維細胞,有研究顯示,體外培養(yǎng)的SSc病人成纖維細胞合成I、III型膠原纖維的量明顯增加;SSc患者成纖維細胞電鏡超微結構存在異常,被認為是研究SSc細胞外基質、膠原形成機制的良好體外模型。此外,國內外研究顯示,多種細胞因子參與了膠原成分表達的調節(jié),其中轉化生長因子-β1(trans

3、forminggrowthfacto-beta,TGF-β)在組織纖維化產生的病理機制中起到最為重要的作用。此外,血管病變和遺傳、環(huán)境因素也被認為參與了SSc的發(fā)病機制。 干細胞是具有很強自身增殖能力及向各種類型細胞分化能力的始祖細胞。 近年,間充質干細胞(mesenchymalstemcell,MSC)由于具備較高的增殖能力、免疫調節(jié)活性和低免疫原性而備受關注,為治療多種疾病提供了新的線索,并且避免了胚胎干細胞研究的倫

4、理學問題,臨床應用優(yōu)勢突出。MSC具有以下的生物學特性:1、潛在的抗增殖作用和免疫調節(jié)活性。體外研究發(fā)現(xiàn),由同種異體刺激引起的混合淋巴細胞增殖反應體系中加入MSC,幾乎使T細胞增殖被完全抑制。在小鼠模型,MSC通過阻斷抗原激活的T細胞進入細胞周期的S期而抑制T細胞的分化;在體外,MSC亦有抑制B細胞增殖的作用,尤其在B細胞與MSC的比例為1:1時,這種作用表現(xiàn)得最強;除了對T、B細胞的抑制作用外,MSC也可抑制單核細胞分化成樹突樣細胞(

5、dendriticcells,DCs)。MSC的免疫調節(jié)活性存在劑量依賴性,非MHC限制性,免疫調節(jié)的可逆性等特點;2、多向分化潛能,促進組織的修復。大量的實驗研究表明,MSC在適宜微環(huán)境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、心肌、上皮細胞等,并且MSC能逃避免疫監(jiān)視,在同種異基因、異種異基因或同種同基因的環(huán)境中長期存活,在移植后仍能保持它的多向分化潛能,從而成為組織工程學的重要種子細胞;3、多器官歸巢能力和可塑性。4、促進造血植入。目前已在

6、骨髓、肝、脾、肺、肌肉、腦、真皮組織中證實有MSC的存在,而皮膚作為人體最大的組織器官,可提供大量的種子細胞,且取材方便,故選擇真皮MSC作為研究的種子細胞具有更廣闊的應用前景。 以往針對SSc免疫系統(tǒng)紊亂和纖維化病變的治療主要集中在免疫抑制劑和抗纖維化藥物如D-青霉胺,秋水仙堿等,但副作用大且收效甚微。隨著干細胞研究的深入,其在治療其他醫(yī)學頑癥上取得了斐然的成績。大量的動物研究發(fā)現(xiàn)MSC局部輸注或系統(tǒng)輸注均可通過分泌各種黏附分

7、子和細胞因子,整合到局部組織或分布全身各器官,發(fā)揮免疫調節(jié)和組織修復的作用,在神經系統(tǒng)、心肌梗死等方面研究較多,對于膠原相關的關節(jié)炎,如類風濕性關節(jié)炎也已進行了初步的研究,但對于與自身免疫和膠原相關的硬皮病的研究尚未見相關報道。 由于MSC在不同的自身免疫性疾病治療中可能通過不同的作用機制發(fā)揮著不同的免疫調節(jié)和組織修復作用,故本實驗擬從細胞水平和動物水平探討MSC對硬皮病的體外模型--硬皮病成纖維細胞(humanfibrobla

8、stofsclerodermapatient,hsFb)和體內模型--硬皮病小鼠模型的作用以及其中的可能機制,為臨床應用MSC治療硬皮病提供理論依據。 材料和方法: 1.小鼠真皮間充質干細胞(Mousedermis-derivedMSCs,mdMSCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定 1.1mdMSCs的分離、培養(yǎng) 取出生1天BALB/C小鼠,胰酶消化,培養(yǎng)貼壁細胞,常規(guī)傳代,分別凍存。 1.2mdMSCs的

9、鑒定 觀察培養(yǎng)所得細胞形態(tài),繪制生長曲線,流式細胞儀檢測細胞周期和表面標志、細胞純度。 1.3mdMSCs的標記 CM-DiI熒光標記分離、純化的mdMSCs。 2.mdMSCs對硬皮病成纖維細胞(humanfibroblastofsclerodermapatient,hsFb)的作用 2.1分離、體外培養(yǎng)hsFb、正常人皮膚成纖維細胞(normalhumanskinfibroblast,hnFb

10、). 2.2將mdMSCs分別與hsFb/hnFb建立Transwell共培養(yǎng)體系,ELISA法檢測共培養(yǎng)體系上清夜中TGF-β1、膠原含量(羥脯氨酸Hyp)的變化。 3.硬皮病動物模型的制備 博來霉素連續(xù)皮下注射BALB/C小鼠,每日1次,共3周,取皮膚活檢,證實造模成功。 4.局部皮損內輸注mdMSCs對硬皮病皮損的作用 4.1選擇不同細胞密度梯度的mdMSCs局部皮損內輸注予硬皮病小鼠模型。

11、 4.2激光共聚焦顯微鏡顯示CM-DiI標記mdMSCs硬皮病小鼠模型皮損內輸注后在局部皮膚內的遷移。 4.3輸注前、后皮損的變化 比較輸注前后皮膚組織Masson染色顯示皮膚膠原含量的變化,初步了解mdMSCs)對硬皮病小鼠皮損的作用。 結果: 1.mdMSCs分離培養(yǎng)第三代細胞中CD44+CD29+,CD80-CD45-細胞純度為92.00%,CM-DiI標記mdMSCs熒光明亮清晰,細胞密度

12、、大小與光鏡下所見基本一致。 2.單獨培養(yǎng)的hsFb和hnFb上清液Hyp含量在第4天無明顯差異,第8天hsFb的Hyp分泌量較hnFb高,差異有顯著性(p<0.05)。 3.mdMSCs2.5×104和mdMSCs1×104與hnFb共培養(yǎng)第8天上清液中Hpy含量較單獨培養(yǎng)時明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);而經各細胞密度mdMSCs處理的hsFb培養(yǎng)上清液中Hpy含量與單獨培養(yǎng)時無顯著性差異。 4.

13、單獨培養(yǎng)的hsFb和hnFb上清液TGF-β1的含量在第4天時無明顯差異,第8天hsFb的TGF-β1分泌量較hnFb高,差異有顯著性(p<0.05)。 5.經mdMSCs2.5×104處理的hsFb培養(yǎng)組,在共培養(yǎng)第4天其上清液中TGF-β1含量較單獨培養(yǎng)時明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),至共培養(yǎng)第8天時與單獨培養(yǎng)時比較無差異(p>0.05)。經mdMSCs處理的各組hnFb培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量于共培養(yǎng)第8

14、天時均高于單獨培養(yǎng),差異有非常顯著性(p<0.01):經mdMSCs1×104處理的hnFb培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量在第4亦高于單獨培養(yǎng),差異有顯著性(p<0.05)。 6.不同細胞密度的MSC處理組的Hyp含量與TGF-β1水平無相關關系(r=0.221,p>0.05);而未經MSC處理的單獨培養(yǎng)hsFb與hnFb組其培養(yǎng)上清液Hyp含量與TGF-β1水平有正相關關系(r=0.682,p<0.01)。 7.BALB

15、/C小鼠背部皮下連續(xù)注射博來霉素3周后成功誘導伴皮膚和肺部損害的硬皮病小鼠模型。 8.硬皮病小鼠模型皮膚內輸注CM-DiI標記mdMSCs后可向表皮和真皮深部、毛囊處遷移。 9.mdMSCs1×107局部皮損內輸注硬皮病小鼠模型后的第2和第3周,皮損區(qū)皮膚Masson染色膠原纖維組織化學指數均較未處理組低,差異有顯著性(P<0.05)。 結論: 1.組織消化-細胞貼壁-傳代培養(yǎng)法能有效培養(yǎng)小鼠真皮MSCs

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