胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對骨髓、臍血、胎盤不同來源造血干細(xì)胞的體外擴增支持作用比較.pdf

1、研究背景及目的
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymal stem cell，MSC)是目前倍受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞。Fridenestein等于1976年最早利用骨髓貼壁層細(xì)胞培養(yǎng)形成了成纖維細(xì)胞和其它間質(zhì)細(xì)胞。隨后其他學(xué)者也描述了來源于骨髓的非造血性貼壁細(xì)胞，可以分化為成熟的間質(zhì)細(xì)胞。認(rèn)為這種原始細(xì)胞可形成骨髓和外膜間質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成造血的微環(huán)境，形成結(jié)締組織骨架并產(chǎn)生細(xì)胞因子、化學(xué)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來調(diào)節(jié)

2、造血細(xì)胞的歸巢和增殖。體外培養(yǎng)MSC分泌多種造血因子，并能表達(dá)多種表面粘附分子，在造血調(diào)控中具有一定的作用。因此，移植MSC使其恢復(fù)骨髓微環(huán)境，支持自體和同種異基因造血干細(xì)胞移植和重建，引起了很多研究者的關(guān)注。
　　 造血干/祖細(xì)胞(hematopoietie Stem/progenitor Cell，HSPC)的擴增和增殖，造血因子是必不可少的。Hyanesworht等培養(yǎng)了可向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的原始間充質(zhì)細(xì)胞，單克隆

3、抗體檢測其表達(dá)SH-2、SH-3和SH-4。在無造血細(xì)胞和分化刺激存在的培養(yǎng)條件下，可產(chǎn)生多種造血相關(guān)因子，包括干細(xì)胞因子(CSF)、白血病抑制因子(LIF)、巨嗜系集落刺激因子(M-CSF)、粒系集落刺激因子(G-CFS)、白細(xì)胞介素IL-6和IL-11。而粒單系集落刺激因子(MG-CSF)、IL-3、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)未被檢測到。用具有能增強骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持造血能力的因子IL-Ia，刺激這種原始間充質(zhì)細(xì)胞，可提高其G-CF

4、S、M-CFS、LIF、IL-6和LI-11的產(chǎn)生水平，而且工IL-Ia還能誘導(dǎo)其產(chǎn)生GM-CSF。Majumdar等比較了骨髓來源的MCS和傳統(tǒng)基質(zhì)細(xì)胞，通過RT-PRC檢測了造血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明MSC穩(wěn)定的表達(dá)多種造血相關(guān)因子IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、-12、IL-14、IL-15、M-CSF、SCF和Flt-3配體(FL)，且IL-11、IL-12的表達(dá)水平明顯高于基質(zhì)細(xì)胞。兩種細(xì)胞在IL-Ia誘導(dǎo)

5、下均表達(dá)G-CFS和GM-CFS，但LIF和IL,Ia的mRNA則只在MSC中被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 目前對造血于細(xì)胞CD34+的體外擴增主要靠加入不同組合的細(xì)胞因子，體外加入的細(xì)胞因子很難模擬造盤的微環(huán)境，且在培養(yǎng)過程中需要不斷加入，價格昂貴，不適合長期培養(yǎng)。近來有研究者用骨髓基質(zhì)支持骨髓來源的CD34+細(xì)胞，用胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞支持臍血來源的CD34+細(xì)胞，也取得很好的效果，胎盤作為胎兒的附屬物，在胎兒娩出后往往作為廢棄物被

6、處理，近年有研究者發(fā)現(xiàn)胎盤組織及胎盤血中存在造血干細(xì)胞，及間充質(zhì)干細(xì)胞，并且研究證實胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種造血相關(guān)因子。因此我們從胎盤中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，作為不同來源的CD34+的滋養(yǎng)層，觀察其對不同來源造血于細(xì)胞的支持?jǐn)U增作用的差別。
　　 材料：
　　 胎盤及臍血樣品：正常健康新鮮的胎盤組織和臍血來自鄭大一附院婦產(chǎn)科。骨髓樣品正常新鮮的骨髓來自鄭大一附院兒科磁性細(xì)胞分選儀及CD34+細(xì)胞分離盒為Miltenyi

7、Biotec公司產(chǎn)品。
　　 細(xì)胞因子和抗體：B-fbf為Gibco公司產(chǎn)品?？笴D29、CD19、CD34、CD44、CD45、HLA-DR、HLA-ABC、CD105、CD106及UEA-I單克隆抗體為ParMingen公司
　　 主要試劑：牛血清白蛋白BSA甲基纖維素、巰基乙醇、谷氨酰胺、氫化考的松、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNaseⅠ酶均購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基，四季青胎牛血清均為Hycl

8、one公司產(chǎn)品。
　　 方法：
　　 1.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：將膠原酶消化后的胎盤組織細(xì)胞用100目的不銹鋼網(wǎng)濾過，去除未消化組織，濾過后的懸液用無菌PBS液洗兩遍，按5×106個細(xì)l接種含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫箱，5％CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁48-72小時后去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，3-4天換液一次。待細(xì)胞80-90％融合后，用胰蛋白酶(0.25％)消化，傳代培養(yǎng)。
　　

9、 2.將傳代3代以上的細(xì)胞用免疫組化方法確定其外形特點。分別取第6、9和12代細(xì)胞，用0.25％的胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，PBS洗滌計數(shù)后，分別與抗CD19,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105,CD106,HLA-DR,HLA-ABC,UEA-1單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30分鐘。PBS液沖洗后，用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志。
　　 3.不同來源血干細(xì)胞CD34+的提?。撼Ｒ?guī)提取骨髓臍血及胎盤組織的單個核細(xì)胞，用免疫磁珠

10、法分離出CD34+細(xì)胞。
　　 4.造血干細(xì)胞細(xì)胞擴增分組：試驗分為A:無滋養(yǎng)層組B：有滋養(yǎng)層組。A組分為A1（骨髓組）A2組（臍血組）A3(胎盤組)；B組分為B1組（骨髓組）B2（臍血組）B3組（胎盤組）每組6復(fù)孔。將不同來源的造血干細(xì)胞分別置于上述培養(yǎng)基中，每周進(jìn)行有核細(xì)胞計數(shù)，CD34+細(xì)胞比例流式檢測，計算CD34+細(xì)胞的擴增倍數(shù)。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)處理計數(shù)資料采用重復(fù)測量的方差分析，判定結(jié)果的差異性
　　

11、 結(jié)果：
　　 1.人胎盤中存在間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層比無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系對CD34+細(xì)胞有明顯的擴增效應(yīng)，以HPDMSCs作為以上三種來源的造血干細(xì)胞的滋養(yǎng)層，對胎盤來源的造血干細(xì)胞支持作用明顯優(yōu)于其他兩組，擴增了(2.6±0.17)倍(8.7±1.2)倍(16.8±2.2)倍(11.6±1.8)倍，臍血次之；擴增了(2.0±0.2)倍(4.3±1.2)倍(11.2±2.4)倍(6.7