人胎盤源間充質(zhì)干細胞對臍血單個核細胞體外生長的支持作用及體內(nèi)移植促進造血重建的實驗研究.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前倍受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的成體干細胞。在不同的誘導條件下，MSCs可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。MSCs的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs的細胞數(shù)量及增殖分化潛能會隨著年齡的增大而下降，且病毒感染率較高，此外供者MSCs的采集需行骨髓穿刺術(shù)，因而MSCs的臨床應(yīng)用存在很大的局限。近年的研究表明，從胎盤中可分離出MSCs，它們和骨髓MSCs

2、一樣，在合適的培養(yǎng)條件下具有多向分化能力。 MSCs作為骨髓造血微環(huán)境中的重要組成成分，它通過分泌多種造血生長因子以及細胞與細胞間的直接接觸等方式作用于造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，因而在造血調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。目前，MSCs已被用來體外支持HSCs擴增，體內(nèi)聯(lián)合HSCs移植促進造血重建。本研究在成功分離培養(yǎng)人胎盤源間充質(zhì)干細胞(placenta-derived mesenchyma

3、l stem cells，PMSCs)的基礎(chǔ)上，探討人PMSCs在體內(nèi)和體外支持造血的功能效應(yīng)。 本文分為兩部分。第一部分闡述了人PMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定，并探討人PMSCs對臍血單個核細胞(MNCs)體外生長的支持作用。將人胎盤組織經(jīng)膠原酶消化、貼壁和傳代培養(yǎng)獲得人PMSCs，運用流式細胞儀檢測其表面標志，分別聯(lián)合應(yīng)用β-甘油磷酸鈉、維生素c、地塞米松體系和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、地塞米松體系將其誘導分

4、化為成骨細胞和脂肪細胞，繼而采用堿性磷酸酶檢測和vonkossa染色對其進行成骨分化鑒定，采用油紅染色對其進行脂肪分化鑒定。將用密度梯度離心法分離的臍血MNCs和傳代后的PMSCs進行共培養(yǎng)，通過細胞計數(shù)和流式細胞儀分別檢測造血細胞的生長情況。 結(jié)果顯示： 1.從人胎盤組織中成功分離和培養(yǎng)PMSCs，貼壁細胞呈成纖維細胞狀，經(jīng)流式細胞儀檢測其表型為CD29+、CD44+、CD105+、CD106+、CD166+、CD34

5、、CD45、HLA-DR； 2.PMSCs經(jīng)成骨誘導3周后，堿性磷酸酶染色呈強陽性，von kossa．染色可見明顯鈣結(jié)節(jié)。PMSCs經(jīng)成脂誘導2周后，油紅染色呈陽性，有明顯的脂滴出現(xiàn)； 3.人PMSCs+臍血MNCs共培養(yǎng)組的細胞總數(shù)和CD45+細胞數(shù)在各培養(yǎng)時間點均明顯高于對照組，在培養(yǎng)第7天，CD45+、CD14+及CD19+細胞數(shù)共培養(yǎng)組也明顯高于對照組。 結(jié)果表明，人PMSCs可以作為滋養(yǎng)層細胞有效支持

6、臍血MNCs的體外生長。 第二部分利用同種異基因小鼠骨髓移植模型，比較經(jīng)骨髓腔內(nèi)注射(intra-bonemarrow injection，IBMI)和外周靜脈輸注(intravenous injection，Ⅳ)兩種途徑移植小鼠骨髓單個核細胞(BMNCs)后受體早期的造血重建情況，建立了小鼠IBMI技術(shù)平臺，并利用IBMI技術(shù)初步探討了人PMSCs聯(lián)合臍血MNCs共移植入SCID鼠體內(nèi)后的早期造血重建效應(yīng)。以BALB/c小鼠為

7、供體，通過IBMI和Ⅳ兩種途徑將其BMNCs移植入經(jīng)致死量輻照預(yù)處理的C57BL/6受鼠體內(nèi)。60只受鼠隨機分為3組：骨髓腔內(nèi)注射高劑量組1(IBM1組)、骨髓腔內(nèi)注射低劑量組2(IBM2組)、尾靜脈注射組(IV組)，每組20只。在骨髓移植后1、3、6、9 d分別計數(shù)各組受鼠脛骨骨髓腔內(nèi)細胞總數(shù)，并用流式細胞儀檢測供體植入水平(供體來源細胞總數(shù)、供體來源髓系細胞數(shù))。以人PMSCs和臍血MNCs為供體，通過IBMI方法或結(jié)合Ⅳ方法，將兩

8、種細胞聯(lián)合或單獨移植入經(jīng)亞致死量輻照預(yù)處理的SCID受鼠體內(nèi)。9只受鼠隨機分為3組：聯(lián)合移植A組(PMSCs+臍血MNCs，IBMI)、單獨移植B組(臍血MNCs，IBMI)、聯(lián)合移植C組(PMSCs經(jīng)IBMI，臍血MNCs經(jīng)Ⅳ)，每組3只。在移植后14 d取各組SCID小鼠注射側(cè)和對側(cè)脛骨腔內(nèi)骨髓細胞，并用流式細胞儀檢測分析人CD34+、CD45+細胞的植入水平。 結(jié)果顯示： 1.IBM1組和IBM2組注射側(cè)于移植后6

9、 d脛骨骨髓腔內(nèi)細胞總數(shù)、供體來源細胞總數(shù)、供體來源髓系細胞總數(shù)均明顯離于Ⅳ組； 2.SCID小鼠移植后14 d，B組注射側(cè)及對側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)的人CD34+、CD45+細胞的酉分比均明顯低于A組小鼠的注射側(cè)和對側(cè)。 結(jié)果表明，IBMI較Ⅳ更能促進同種異基因骨髓移植后的早期造血功能重建；人PMSCs可以增加臍血MNCs的植入，促進造血重建。 綜上所述，本實驗從人胎盤組織中成功分離培養(yǎng)獲得PMSCs，人PMSCs在體