臍血間充質干細胞的體外培養(yǎng)、生物學特性和臍血單個核細胞移植治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷的研究.pdf

1、目的:研究臍帶血(human umbilical cord blood，HUCB)來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外分離、純化及培養(yǎng)的條件，以建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)體系，滿足實驗和臨床的需要，并將臍血單個核細胞(MNC)移植到發(fā)生缺氧缺血性腦病的新生鼠腦內，觀察其是否可以存活、分化及大鼠的學習和記憶變化。 方法:密度梯度法分離臍血單個核細胞。16份臍血每份分為3組，分別將單個核細胞按密度

2、1×10<'4>/ml、1×10<'6>/ml和1×10<'8>/ml接種于未包被6孔培養(yǎng)板內，加入5％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)。另20份臍血每份分為3組，以1×10<'8>/ml單個核細胞密度分別加入5％、10％和120％胎牛血清的DMEM-LG接種于胎牛血清包被的6孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)。采用常規(guī)的間充質干細胞培養(yǎng)Friedenstein法進行臍血間充質干細胞的培養(yǎng)和擴增培養(yǎng)。觀察不同臍血單個核細胞的接種密度、培養(yǎng)液胎牛血清濃度和胎牛血

3、清包被培養(yǎng)皿對間充質干細胞培養(yǎng)的影響。采用流式細胞儀檢測MSCs相關抗原。將30只7d齡新生Wister大鼠隨機分成MNC移植組、假手術組和假移植組各10只。MNC移植組行腦缺氧缺血并腦內移植5-溴脫氧尿核苷(Brdu)標記的臍血單個核細胞；假手術組僅分離頸總動脈但不結扎；假移植組行腦缺氧缺血，腦內注射生理鹽水。采用Y型迷宮觀察新生鼠的行為改變，免疫組化分析腦組織移植細胞的定位和分化情況。 結果:胎牛血清未包被組以1×10<'4

4、>/ml、1×10<'6>/ml接種組培養(yǎng)7d后貼壁數量很少，貼壁的細胞未長滿瓶底即死亡，無法傳代；1×10<'8>/ml組貼壁細胞較多，間充質樣細胞與破骨樣細胞并存。1×10<'8>ml組分5％、10％、20％3種血清濃度，貼壁細胞均較多，以間充質干細胞為主，胎牛血清濃度5％組間充質干細胞的純度較10％及20％組高，破骨樣細胞相對較少；胎牛血清包被組與未包被組相比，貼壁細胞少，培養(yǎng)的間充質干細胞純度較高，破骨樣細胞相對較少。流式細胞儀

5、檢測顯示培養(yǎng)出的間充質樣細胞表達MSCs相關抗原。接受神經干細胞移植組大鼠的學習能力、記憶能力和對照組相比，有明顯提高，差異具有顯著性(P<0.05)。臍血單個核細胞移植后腦組織免疫組化結果顯示：MNO移植組中，進針注射部位存在大量移植細胞，并向周圍遷移，皮質層、海馬等部位檢測到移植細胞；所植入的細胞約6％表達膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，約8％表達神經原特異性的微管相關蛋白2(MAP2)。 結論:將臍血單個核細胞以高密度(1×