人羊膜間充質細胞移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的影響及其機理探討.pdf

1、第一部分體外培養(yǎng)人羊膜間充質細胞的神經生物學特征研究
　　 目的:探討體外培養(yǎng)的人羊膜間充質細胞(human amnion mesenchymal cells,hAMCs)的神經生物學特征、神經營養(yǎng)作用,以及hAMCs與新生鼠腦組織液共培養(yǎng)后向神經細胞分化的潛能。
　　 方法:
　　 1.應用免疫細胞化學法檢測hAMCs的間充質細胞標記蛋白STRO-1、vimentin,神經干細胞標記蛋白nestin、PSA-N

2、CAM,神經細胞標記蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,以及與神經發(fā)生相關蛋白Math-1、Mash-1的表達。應用PCNA形態(tài)學檢測、BrdU摻入法和MTS法確認hAMCs的增殖活性。
　　 2.ELISA檢測培養(yǎng)7d后的hAMCs內及細胞培養(yǎng)上清液中的神經營養(yǎng)因子NT3、β-NGF和BDNF的合成分泌狀態(tài)。
　　 3.將10日齡新生SD大鼠腦組織勻漿上清液與hAMCs共培養(yǎng)10d后,應用免疫蛋白印記法比較共培養(yǎng)前后vi

3、mentin、NSE、NF表達的變化。
　　 結果:
　　 1.體外培養(yǎng)的hAMCs不僅表達問充質干細胞標記蛋白STRO-1和vimentin,還可見神經干細胞標記蛋白nestin和PSA-NCAM的表達；
　　 2.體外培養(yǎng)的hAMCs表達神經元標記蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,同時還表達神經發(fā)生相關蛋白Math-1、Mash-1；
　　 3.hAMCs表現(xiàn)為PCNA和BrdU免疫熒光染色陽性；

4、r>　　 4.MTS分析法顯示hAMCs在接種后第6～8d增殖速度最快,第8～24d活細胞數(shù)基本保持穩(wěn)定。
　　 5.部分hAMCs表現(xiàn)為TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU雙陽性。
　　 6.hAMCs內及細胞上清中均檢測到不同水平的NT3、β-NGF和BDNF神經營養(yǎng)因子的合成分泌。7.與新生大鼠腦組織上清液共培養(yǎng)后,hAMCs的vimentin、神經元特異性標記蛋白NSE、NF的表達數(shù)量顯著增加。

5、r>　　 結論:體外培養(yǎng)的hAMCs表達神經干細胞和神經元的特異性標記蛋白,并且具有增殖活性和神經細胞分化潛能。體外培養(yǎng)hAMCs能夠分化為神經細胞,這可能與神經元分化相關基因Math-1、Mash-1的表達有關。此外,hAMCs可以合成和分泌多種具有神經保護和修復作用的神經營養(yǎng)因子。新生鼠腦中存在的神經營養(yǎng)因子,能夠促使hAMCs向神經元方向分化,提示腦內具有有利于hAMCs向神經細胞分化的微環(huán)境。
　　 第二部分體外培養(yǎng)人

6、羊膜間充質細胞向血管內皮細胞誘導分化的研究
　　 目的:探討hAMCs在體外誘導分化為血管內皮樣細胞的潛能,以期作為細胞移植治療缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)的種子細胞。
　　 方法:
　　 1.從健康產婦足月剖宮產后廢棄的人羊膜組織分離培養(yǎng)hAMCs,利用細胞培養(yǎng)技術完善體外擴增培養(yǎng)方法,并對其相關生物學特性進行鑒定。
　　 2.使用添加血管內皮

7、細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的血管內皮細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMCs,觀察細胞形態(tài)特征,用免疫熒光染色和Western-Blot的方法檢測血管內皮細胞特異性標記蛋白CD31、vWF和VEGFR-2的表達。
　　 結果:
　　 1.原代培養(yǎng)的hAMCs形態(tài)呈長梭形或不規(guī)則形,呈均勻分布生長,傳代后細胞體積略變大,約5～7d傳代1次。
　　 2.體外培養(yǎng)的hAMCs表達間充質干細胞(me

8、senchymal stem cells,MSCs)特異性標記物STRO-1和vimentin。經成血管內皮細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)12d后,hAMCs中有CD31、vWF和VEGFR-2表達陽性的細胞。
　　 結論:hAMCs易于體外分離培養(yǎng)及擴增,體外定向誘導的hAMCs具有向血管內皮細胞分化的潛能,可能成為治療HIBI的供體細胞。
　　 第三部分人羊膜間充質細胞移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的影響
　　 目的:觀

9、察hAMCs移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischaemic braininjury,HIBI)的影響。
　　 方法:從健康產婦足月剖宮產后廢棄的人羊膜組織分離培養(yǎng)hAMCs。采用新生7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠結扎左頸總動脈后低氧暴露4h制作HIBI模型。建模72h后,移植組(n=33)經損傷側腦內直接注射hAMCs2×104細胞/4μ1基礎培養(yǎng)基,移植對照組(n=23)則注入等量的基礎培養(yǎng)

10、基。觀察HIBI后大鼠體重增長情況,行為能力以及腦組織病理形態(tài)學改變；觀察hAMCs移植對新生大鼠存活率、體重增長的影響；移植后7d應用HNA和HMA免疫組織化學染色檢測hAMCS在腦內的存活情況；移植后11d用ELISA法檢測移植后對腦內NT3、β-NGF和BDNF水平的影響。
　　 結果:
　　 1.HIBI模型組體重增長明顯落后于空白對照組和假手術組；HIBI制模后大鼠出現(xiàn)不同程度的神經功能受損表現(xiàn)；HE染色可見左

11、側大腦半球神經元損傷及神經膠質細胞增生。
　　 2.移植組和移植對照組的死亡率無差異；d7后移植組的體重增長率較移植對照組逐漸增高。
　　 3.在移植大鼠的皮層下部分區(qū)域均發(fā)現(xiàn)了人源性細胞特異性標記蛋白HNA和HMA陽性細胞的表達。
　　 4.移植后大鼠腦組織中NT3和BDNF較移植對照組增加,有統(tǒng)計學差異；而β-NGF含量無明顯變化。
　　 結論:本研究中新生大鼠HIBI模型是可靠的。hAMCs腦內移植