丹參誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)性分化治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷.pdf

1、目的：探討丹參誘導(dǎo)骨隨間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞優(yōu)化方案可行性及分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞是否具有神經(jīng)生理功能。 方法：取4～5代狀態(tài)好的MSC加入含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及10ng/ml的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast GrowthFactor,bFGF)的培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24h，更換為含60mg/L丹參液和10ng/m

2、l bFGF的無血清培養(yǎng)基(誘導(dǎo)液)誘導(dǎo)2h，加FBS(工作濃度為10％)進(jìn)行去分化，約24h后再次更換為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3h，如此重復(fù)4～5次，且每次誘導(dǎo)時(shí)間較前延長(zhǎng)1h，誘導(dǎo)后分別進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)，細(xì)胞膜電位(Membrane potential，MP)、細(xì)胞內(nèi)鈣流以及神經(jīng)突觸循環(huán)功能檢測(cè)。以50mmol/L的KCl作為誘發(fā)動(dòng)作電位刺激因子，采用激光共聚焦顯微鏡(Laser-scanning confocal microscope，L

3、SCM)對(duì)DiBAC4(3)、Fluo-3/AM、SynaptoRed C-2進(jìn)行熒光激發(fā)，檢測(cè)分化神經(jīng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外高鉀刺激下細(xì)胞膜電位變化，胞內(nèi)鈣流變化及細(xì)胞突觸循環(huán)功能。 結(jié)果：加入預(yù)誘導(dǎo)液24h內(nèi)，MSC形態(tài)未見明顯改變；更換為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2h即可見部分MSC開始收縮，伸出突起，向神經(jīng)性細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，5次誘導(dǎo)6小時(shí)后，細(xì)胞胞體繼續(xù)縮小，突起拉長(zhǎng)交互成復(fù)雜網(wǎng)狀；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)顯示未經(jīng)處理的MSC神經(jīng)元巢蛋白(Nestin，神

4、經(jīng)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志)表達(dá)率為(41.6±3.3)％(-x±s，n=3)，第1次誘導(dǎo)2h后，Nestin表達(dá)率高達(dá)(98.1±1.5)％(-x±s，n=3)，但不表達(dá)神經(jīng)微絲蛋白(Neurofilament protein，NF，成熟神經(jīng)元表面標(biāo)志)、TUJ-1(成熟神經(jīng)元表面標(biāo)志)及突觸小泡蛋白(Synaptophysin，成熟神經(jīng)元表面標(biāo)志)，也不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein，G

5、FAP，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志)；第4次誘導(dǎo)1h后即突觸Synaptophysin，表達(dá)率(95.3±1.6)％(-x±s，n=3)，5h后Synaptophysin表達(dá)更為廣泛。5次誘導(dǎo)6h后的神經(jīng)樣細(xì)胞TUJ-1、NF、Synaptophysin均表達(dá)陽(yáng)性，TUJ-1表達(dá)率為(96.6±2.4)％(-x±s，n=3)，NF表達(dá)率為(96.7±2.8)％(-x±s，n=3)，Synaptophysin表達(dá)率為(96.2±2.1)％(-x

6、±s，n=3)。膜電位檢測(cè)顯示加入高濃度KCl后，神經(jīng)樣細(xì)胞胞內(nèi)熒光強(qiáng)度瞬時(shí)增強(qiáng)，膜電位變化曲線發(fā)生瞬時(shí)陡升，而MSC未發(fā)生任何變化，曲線保持于水平線。鈣流檢測(cè)顯示神經(jīng)樣細(xì)胞受高鉀刺激前，其胞內(nèi)鈣流在小范圍內(nèi)波動(dòng)，被高鉀刺激后，熒光強(qiáng)度瞬時(shí)增強(qiáng)，增強(qiáng)幅度遠(yuǎn)高于刺激前，說明胞內(nèi)鈣流增強(qiáng)。突觸循環(huán)檢測(cè)顯示神經(jīng)樣細(xì)胞首次被高鉀激發(fā)后細(xì)胞被SynaptoRed-C2染色發(fā)出紅色熒光，當(dāng)再次被高鉀激發(fā)后細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞在兩次高鉀刺激后發(fā)生胞