混合培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療HIBD新生大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(neonatal hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是導(dǎo)致新生兒死亡和兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要因?yàn)橹?目前對(duì)重度HIBD尚無特異有效的治療辦法。近年來隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展,干細(xì)胞移植為新生兒HIBD的治療開辟了一條新途徑。干細(xì)胞移植是近年來整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿,因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能而成為細(xì)胞移植和組織工程中的首選細(xì)胞。
　　 造血

2、干細(xì)胞/祖細(xì)胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitorcell,HSC/HPC)存在于人臍血(human umbilical cord blood,HUCB)中,臍血中造血干細(xì)胞被成功的發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)在臨床中用于異體細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)疾病。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是否存在于臍血中仍不十分明確。最近幾年的研究中顯示,在臍血里能培養(yǎng)出MSCs

3、來,臍血MSCs與骨髓MSCs具有相近的性質(zhì),并有多向分化潛能,它處于一定的環(huán)境中就能定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。臍血MSCs移植治療在缺氧缺血性腦損傷和腦脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,觀察到移植細(xì)胞在腦組織內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。但是,在臨床上治療一些疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)單份臍血細(xì)胞數(shù)量不足,為實(shí)驗(yàn)研究和臨床工作帶來了一些困擾,又有文獻(xiàn)報(bào)道兩份臍血混合培養(yǎng)后細(xì)胞增殖快,數(shù)量多,為彌補(bǔ)臨床應(yīng)用單份臍血MSCs數(shù)量不足提供了

4、良好的理論依據(jù)。
　　 目的
　　 觀察是否能從健康足月新生兒臍血中培養(yǎng)出臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),觀察混合培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和單份培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況,探討腦內(nèi)移植混)合培養(yǎng)的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的治療效果。為進(jìn)一步進(jìn)行臍血MSCs移植治療新生兒HIBD的臨床應(yīng)用,提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論根據(jù)。
　　 方法：
　　 無菌條件下收集20份健康足

5、月新生兒臍血,采用密度梯度離心法分離出臍血單個(gè)核細(xì)胞,再通過貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)出人臍血MSCs。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí),隨機(jī)取培養(yǎng)的8份臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(半量)為A組,8份臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(半量)為B組,將A、B組各剩余的半量臍血間充質(zhì)干細(xì)胞混合為C組。3組細(xì)胞密度均為1.0×106/ml?；旌吓囵B(yǎng)的第3代臍血MSCs用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD86、CD34、HLA-DR、HLA-ABC的表達(dá)。選擇P3代人臍血MSCs作為移植細(xì)胞,并

6、經(jīng)5-溴-2脫氧尿苷(BrdU)體外標(biāo)記。7日齡SD大鼠50只制備HIBD模型,造模過程中死亡3只,隨機(jī)選擇5只進(jìn)行HE染色,剩余42只分為混合移植組(n=16)和單份移植組(n=16)和對(duì)照組(n=10)。造模后第3天,在立體定位條件下,移植組大鼠經(jīng)左側(cè)大腦皮層注入人臍血MSCs,對(duì)照組在相同部位注入相同體積的PBS。在細(xì)胞移植后第7天,各隨機(jī)選擇6只移植組大鼠處死取腦,通過腦組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移情況

7、。于移植后第1、7、14、21、28天采用改良神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(mNSS)方法對(duì)三組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示,將2份不同臍血間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后,細(xì)胞增殖比單份臍血間充質(zhì)干細(xì)胞快(P<0.05)。造模后HE染色可見大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,胞質(zhì)皺縮,核濃縮深染,核仁消失,胞漿疏松,間質(zhì)水腫。海馬區(qū)錐體細(xì)胞變性,細(xì)胞間隙增大,排列紊亂。移植7天后移植組大鼠腦組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)移植細(xì)

8、胞在腦內(nèi)能夠存活,并以移植點(diǎn)為中心向周圍遷移,混合移植組的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)多于單份組(P<0.05)。mNSS檢測(cè)結(jié)果顯示,移植后第1天移植組大鼠mNSS低于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),第7、14、21、28天移植組大鼠mNSS低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7、14、21、28天混合移植組大鼠的mNSS低于單份移植組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1在適宜的體