激活態(tài)雪旺細(xì)胞聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]：觀察激活態(tài)雪旺細(xì)胞(ActivatedSchwanncells，ASCs)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(HumanUmbilicalCordBloodMesenchymalStemCells，HUCBMSCs)神經(jīng)方向分化的作用。同時(shí)評(píng)價(jià)脊髓損傷局部微環(huán)境對(duì)HUCBMSCs分化影響。探討ASCs與HUCBMSCs聯(lián)合移植在促進(jìn)大鼠脊髓損傷后軸突再生和功能恢復(fù)方面所起的作用。
　　[方法]：結(jié)扎成年Wistar

2、大鼠雙側(cè)隱神經(jīng)近端，一周后取下結(jié)扎處遠(yuǎn)端的隱神經(jīng)，采用雙酶消化組織塊法結(jié)合機(jī)械分離法分離培養(yǎng)ASCs；Ficoll法分離得到的人臍血單個(gè)核細(xì)胞(HumanCordBloodMononuclearCells，HCMNCs)并經(jīng)貼壁培養(yǎng)、分離后獲得HUCBMSCs。采用全反式微甲酸+bFGF+EGF(含50ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、50ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、0.5μmol/L全反式維甲酸和10％FBS的D

3、MEM/F12培養(yǎng)液，對(duì)照組)、體外ASCs培養(yǎng)基半量換液法(實(shí)驗(yàn)組)及體內(nèi)共移植誘導(dǎo)HUCBMSCs向神經(jīng)方向分化(空白對(duì)照組、ASCs移植組、HUCBMSCs移植組、ASCs+HUCBMSCs移植組)，應(yīng)用免疫組化、Western-Bolt半定量、Real-timePCR(NF200、GFAP、MBP)定量分析等方法在誘導(dǎo)培養(yǎng)后1、2、3、4周進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)HUCBMSCs誘導(dǎo)分化情況，分析其神經(jīng)標(biāo)志性蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)，用NYUI

4、mpactor-Ⅱ打擊器制作成年雌性Wistar大鼠胸10脊髓損傷模型(打擊重量和高度為：10g×50mm)。將80只大鼠隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組(注射DMEM)；ASCs移植組；HUCBMSCs移植組；ASCs與HUCBMSCs聯(lián)合移植組。分別將DMEM，消化后的ASCs，HUCBMSCs，以及ASC+BMSC移植入對(duì)應(yīng)組的脊髓損傷部位。術(shù)后采用BBB評(píng)分對(duì)大鼠的后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。12周后，從每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行10％BD

5、A順行示蹤標(biāo)記。標(biāo)記兩周后處死動(dòng)物，將損傷段脊髓取出作5μm快速冰凍切片后，進(jìn)行BDA顯影、HE染色，NF200、GFAP、MBP免疫組化染色。綜合以上數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　[結(jié)果]：ASCs和HUCBMSCs經(jīng)分離，純化后可以在體外分別穩(wěn)定的傳4代和6代以上；NF200、GFAP、MBP免疫組化染色結(jié)果可以證實(shí)HUCBMSCs在ASCs和全反式微甲酸及bFGF、EGF的作用下向神經(jīng)源性細(xì)胞分化。Western-Bolt半定

6、量、Real-timePCR(NF200、GFAP、MBP)定量分析結(jié)果顯示兩種誘導(dǎo)方法比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。損傷后4周開(kāi)始，共移植組動(dòng)物的BBB評(píng)分顯著高于其余3組(p<0.05)。BDA順行示蹤標(biāo)記顯示共移植組較ASCs移植組和HUCBMSCs移植組有較多的再生神經(jīng)纖維通過(guò)損傷區(qū)，而空白對(duì)照組幾乎未見(jiàn)再生神經(jīng)纖維穿越。HE染色顯示細(xì)胞共移植組損傷空洞明顯小于其余三組(p<0.05)。
　　[結(jié)論]：ASCs可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子