人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為類許旺細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、背景：當(dāng)今社會(huì)周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率特別高，對(duì)于缺損長度超過2cm的損傷目前尚無理想的解決辦法，近些年生物工程學(xué)的發(fā)展和干細(xì)胞研究深入開展給神經(jīng)損傷的治療帶來新希望。種子細(xì)胞即許旺細(xì)胞一直是研究的“瓶頸”，自體及異體的許旺細(xì)胞因其自身的缺點(diǎn)未能得到大規(guī)模使用，由干細(xì)胞體外誘導(dǎo)而來的類許旺細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景，如何證明所誘導(dǎo)的類許旺細(xì)胞具有許旺細(xì)胞的功能至關(guān)重要，許旺細(xì)胞具有強(qiáng)大的自分泌和旁分泌功能，這可能是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制之一，因

2、此如能證明所誘導(dǎo)的類許旺細(xì)胞可以分泌真正許旺細(xì)胞分泌的一些功能性蛋白，則可以為后期的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　目的：分別收集人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的類許旺細(xì)胞以及人引產(chǎn)胎兒來源的許旺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提取其中的蛋白，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)比較三種細(xì)胞的分泌蛋白差異性及相似性，查詢相關(guān)蛋白的主要功能。
　　方法：按照本課題組之前使用的先用羥乙基淀粉沉淀紅細(xì)胞，再運(yùn)用人淋巴細(xì)胞分離液離心提取原代間充質(zhì)干細(xì)

3、胞，通過形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面標(biāo)志物等方法鑒定和測定其純度，符合要求者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，取第三代干細(xì)胞采用本課題組之前優(yōu)化的誘導(dǎo)方法進(jìn)行體外人工誘導(dǎo)。采用酶消化法制備人許旺細(xì)胞。對(duì)三種細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞，類許旺細(xì)胞，許旺細(xì)胞）采用“逐步過度法”過度到無血清培養(yǎng)，收集三種細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用0.22um濾器過濾去除殘留細(xì)胞，加入1mM濃度的蛋白酶抑制劑后放入超低溫冰箱（-80℃）備用。提取培養(yǎng)液里的分泌蛋白，運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)

4、尋找差異顯著蛋白，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞比許旺細(xì)胞少的蛋白和類許旺細(xì)胞比間充質(zhì)干細(xì)胞多的蛋白進(jìn)行匹配，查詢其蛋白的主要功能。
　　結(jié)果：
　　1.2-D凝膠電泳圖具有較好的分辨率及重復(fù)性，平均每張膠的蛋白表達(dá)點(diǎn)有三千左右，匹配率各自是96％、97%、98%。
　　2.誘導(dǎo)前的HUCBMSCs與SCs有397個(gè)蛋白差異點(diǎn)，誘導(dǎo)后的類SCs與SCs僅有280個(gè)差異蛋白點(diǎn)，說明間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為類許旺細(xì)胞后在分泌蛋白組學(xué)方面更相似于

5、許旺細(xì)胞。
　　3.對(duì)于按照篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出的12個(gè)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，最終鑒定出7個(gè)蛋白。（剩下五個(gè)因蛋白濃度較低無法成功鑒定出來）
　　4.鑒定出的上述分泌蛋白經(jīng)查文獻(xiàn)得知大部分對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.使用羥乙基淀粉和人淋巴細(xì)胞分離液可提取原代的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后在分泌蛋白方面更接近真正的許旺細(xì)胞。
　　3.本實(shí)驗(yàn)成功鑒定出間充質(zhì)干細(xì)