人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性的類許旺細(xì)胞與人胎兒坐骨神經(jīng)許旺細(xì)胞差異蛋白組學(xué)的研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)損傷缺損的臨床治療是世界難題，自體神經(jīng)移植是金方法，但會造成供區(qū)神經(jīng)損傷。通過組織工程化的人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)。人工神經(jīng)的種子細(xì)胞為SCs(Schwann cells,SCs)，其來源主要有自體SCs、異體SCs、以及由間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）定向誘導(dǎo)分化而來，而MSCs誘導(dǎo)而來的類SCs以其來源廣泛，活性強(qiáng)更受學(xué)者青睞。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(Human

2、Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)作為最先應(yīng)用的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的一種替代來源，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中已證明其具有向 SCs分化的能力，但是其生物學(xué)行為和正常SCs有哪些異同之處還有待進(jìn)一步研究。
　　目的：本研究旨在建立人胎兒坐骨神經(jīng)SCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定體系，結(jié)合本課題組以往的HUCBMSCs培

3、養(yǎng)及體外誘導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)，將HUCBMSCs、HUCBMSCs體外誘導(dǎo)后的類SCs以及人SCs三種細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，尋找差異蛋白點(diǎn)。
　　方法：采用課題組既往HUCBMSCs培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)方法獲得HUCBMSCs以及類SCs；取藥物引產(chǎn)的10具12~16周人胎兒胎坐骨神經(jīng)，剝離神經(jīng)外膜、剪碎、消化、離心、培養(yǎng)，待長滿瓶底后，分 A組采用低酶消化、差速貼壁以及 D-Valine條件培養(yǎng)基純化 SCs；B組采用低酶消化結(jié)合差速貼壁純化

4、法純化；C組采用D-Valine條件培養(yǎng)基純化法；D組不采用任何純化處理。根據(jù) SCs特有顯微鏡下形態(tài)統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞純度，選取純度最高的一組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。提取這三種細(xì)胞的總蛋白，利用雙向凝膠電泳分離蛋白并銀染，利用ImageMaster軟件進(jìn)行分析對比，選取HUCBMSCs與SCs相比表達(dá)低的點(diǎn)和HUCBMSCs誘導(dǎo)過程中增加的蛋白點(diǎn)之間的匹配點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，并選取適當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證。
　　結(jié)果：1）采用低酶消化、差速貼壁以

5、及D-Valine條件培養(yǎng)基純化的SCs的純度5d后達(dá)到99.1％。2）得到分辨率和重復(fù)性均較好的雙向凝膠電泳圖譜，每組膠的蛋白表達(dá)點(diǎn)為3500個上下，平均匹配率分別為98%、95%、97%。3）誘導(dǎo)前的HUCBMSCs與SCs有290個蛋白差異點(diǎn)，誘導(dǎo)后的類SCs與SCs僅有161個差異蛋白點(diǎn)，表明誘導(dǎo)后的HUCBMSCs在蛋白質(zhì)組成方面更加接近SCs。4）對篩選出的41個蛋白匹配點(diǎn)，其中有25個蛋白點(diǎn)差異超過3倍，取這25個蛋白點(diǎn)進(jìn)

6、行質(zhì)譜分析最終共有20個點(diǎn)被成功鑒定，分別屬于細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞調(diào)控蛋白、能量代謝蛋白以及蛋白酶類蛋白，其中包含兩種公認(rèn)的SCs標(biāo)記蛋白（S100β及GFAP）。5）在這20個蛋白點(diǎn)中選取3種蛋白進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果基本與雙向電泳及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.通過低酶消化、差速貼壁以及 D-Valine條件培養(yǎng)基相結(jié)合純化 SCs的方法培養(yǎng)SCs所需時間較短，純度更高，能夠?yàn)橄乱徊降纳窠?jīng)組織工程提供細(xì)胞來

7、源。
　　2. HUCBMSCs誘導(dǎo)后在蛋白質(zhì)構(gòu)成方面更加接近正常的SCs。
　　3.本實(shí)驗(yàn)成功鑒定出的20個蛋白點(diǎn)，分別屬于細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞調(diào)控蛋白、能量代謝蛋白以及蛋白酶類蛋白，這些蛋白的含量變化是由于誘導(dǎo)劑刺激細(xì)胞產(chǎn)生的，大多數(shù)對于神經(jīng)的分化與生長起著重要的作用，這其中還包含兩種公認(rèn)的SCs標(biāo)記蛋白（S100β及GFAP）。
　　4.這些差異蛋白的尋找對于今后更好的優(yōu)化體外誘導(dǎo)方案以及指導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外的定