脫細胞神經(jīng)支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)細胞修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損.pdf

1、目的: 顯微外科技術(shù)的發(fā)展極大地提高了周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的質(zhì)量，但修復(fù)由創(chuàng)傷、腫瘤切除以及先天性畸形等原因引起的較嚴重周圍神經(jīng)缺損時效果欠佳。修復(fù)與重建是周圍神經(jīng)組織工程研究的熱點問題。在臨床上，周圍神經(jīng)損傷后自體神經(jīng)移植是首選的神經(jīng)重建方法，但存在著感覺恢復(fù)不全或感覺障礙、供體來源受限、手術(shù)時間過長等缺點。高分子聚合材料PDLLA、PLGA等已被制成神經(jīng)導(dǎo)管用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實驗研究，但因缺乏支持神經(jīng)再生的活性細胞，神經(jīng)再生

2、的細胞外基質(zhì)成分、生長因子等，不具備正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)而影響神經(jīng)再生效果。本研究的目的：①采用脫細胞神經(jīng)基質(zhì)移植物(ANA)體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細胞(BMSCs)分化為施萬細胞樣細胞。探討ANA誘導(dǎo)BMSCs向施萬細胞方向分化的可行性，為體外誘導(dǎo)BMSCs向施萬細胞方向的分化提供新的思路，為周圍神經(jīng)組織工程提供來源方便的種子細胞奠定實驗基礎(chǔ)。②觀察脫細胞神經(jīng)支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)細胞、構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效果，為神經(jīng)組織工

3、程研究與臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 材料和方法: 1、取3w齡SD大鼠一只，脫臼處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，5ml注射器沖洗骨髓腔，收集沖洗液離心，制成單細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，貼壁法分離、純化、增殖骨髓間充質(zhì)細胞，以ANA勻漿做誘導(dǎo)劑，對體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)細胞進行表型鑒定，取第5代細胞進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)組加入ANA勻漿液，未誘導(dǎo)組加入等量培養(yǎng)基； 2、加入誘導(dǎo)劑后每6h觀察細胞形態(tài)變化，免疫細胞化學(xué)染色和流

4、式細胞儀分別檢測細胞中S-100、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況；RT-PCR檢測誘導(dǎo)前后細胞GFAP及S-100 mRNA表達的變化；MTT法檢測不同誘導(dǎo)劑濃度誘導(dǎo)后的細胞活性； 3、取傳至5代的BMSCs與脫細胞神經(jīng)支架復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建移植物。SD成年大鼠18只，隨機均分為3組：①實驗組(ANA復(fù)合BMSCs移植)；②支架組(ANA移植)；③對照組(自體神經(jīng)移植)。術(shù)后12W，采用坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定、腓腸肌濕質(zhì)量

5、恢復(fù)率檢測及組織學(xué)等方法評價神經(jīng)缺損的修復(fù)效果。 結(jié)果: 1、培養(yǎng)純化第5代的細胞CD44+，CD54+，CD34-；免疫細胞化學(xué)染色顯示：誘導(dǎo)后細胞GFAP，S-100陽性細胞比例分別為(64±5)％，(42±4)％，未誘導(dǎo)的細胞二者均無陽性表達；流式細胞儀檢測誘導(dǎo)后的細胞GFAP及S-100表達較未誘導(dǎo)細胞升高；RT-PCR反應(yīng)顯示誘導(dǎo)后的細胞表達GFAP及S-100，未誘導(dǎo)細胞二者均不表達；MTT法檢測結(jié)果表明誘導(dǎo)

6、劑濃度為1.0mg/ml時誘導(dǎo)后有活性細胞數(shù)最多； 2、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)及腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率的檢測顯示實驗組優(yōu)于支架組，與對照組相似；組織學(xué)檢查，實驗組修復(fù)神經(jīng)S-100蛋白表達明顯強于支架組，足底皮膚單位面積內(nèi)觸覺小體數(shù)明顯多于支架組，實驗組縫合神經(jīng)有效神經(jīng)截面積、有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、有髓神經(jīng)纖維密度、有髓神經(jīng)纖維直徑、髓鞘厚度均優(yōu)于支架組，其坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)效果接近對照組。 結(jié)論: 1、脫細胞神經(jīng)支架可誘導(dǎo)骨髓