骨髓基質(zhì)干細胞復(fù)合去細胞神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損及其機制的初步研究.pdf

1、背景和目的:
　　 外傷導(dǎo)致的周圍神經(jīng)缺損是臨床常見的致殘性疾病，要恢復(fù)神經(jīng)功能就必須先恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性。目前，自體神經(jīng)移植是修復(fù)神經(jīng)缺損的主要方法，但存在來源有限、規(guī)格難以匹配以及供區(qū)功能喪失等客觀問題。同種異體或異種神經(jīng)是很理想的神經(jīng)移植材料來源，但直接植入修復(fù)必然引起受體強烈的免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致治療失敗。組織工程化周圍神經(jīng)的研制為周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)帶來了新的希望，其研究內(nèi)容主要是：模擬正常神經(jīng)的構(gòu)造，將具有促進周圍神經(jīng)再生

2、的種子細胞種植于天然或人工合成的支架材料中，用于橋接長段的神經(jīng)缺損。
　　 骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細胞，易于體外進行分離、提純和大量的擴增。許多研究表明BMSCs在體外可以誘導(dǎo)分化為類許旺細胞，植入體內(nèi)能促進周圍神經(jīng)再生，近來部分學(xué)者還證明其在體內(nèi)周圍神經(jīng)再生微環(huán)境下也能分化為類許旺細胞而發(fā)揮作用，但具體相關(guān)機制仍未研究清楚。

3、>　　 本實驗將體外分離培養(yǎng)的同種異體大鼠BMSCs與去細胞同種異體神經(jīng)支架復(fù)合，移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，觀察其功能恢復(fù)及坐骨神經(jīng)再生的情況，檢測植入的BMSCs在體內(nèi)存活、分化、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的情況，以及前角運動神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元存活情況，初步探索闡明BMSCs促進大鼠坐骨神經(jīng)再生的可能機制。
　　 方法:
　　 1.PKH26標記結(jié)合DAPI復(fù)染的方法在組織工程神經(jīng)種子細胞體內(nèi)示蹤中的應(yīng)用研究。

4、>　　 1.1 大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)及流式檢測。
　　 取體重為100g左右的雄性Wistar大鼠6只，無菌條件下切取雙側(cè)股骨和脛骨，用5mL無菌注射器及DMEM培養(yǎng)基沖洗髓腔獲得細胞懸液，用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法分離、培養(yǎng)原代BMSCs。行傳代培養(yǎng)至第3代，用胰酶消化收集細胞，流式細胞儀檢測細胞表面標志CD29、CD44的表達及細胞周期情況。
　　 1.2 PKH26標記BMSCs及細胞生物活性的檢測。
　　

5、 用PKH26熒光染料進行標記，熒光顯微鏡下觀察標記效果，流式細胞儀檢測熒光標記率，MTT法測定細胞的活性，體外成脂和成骨誘導(dǎo)鑒定細胞的分化能力，并與未標記細胞進行比較。
　　 1.3 BMSCs復(fù)合去細胞神經(jīng)支架在體外示蹤實驗。
　　 取Wistar大鼠坐骨神經(jīng)24條，剝除神經(jīng)周圍結(jié)締組織，依次用蒸餾水、3％TritonX-100和4％脫氧膽酸鈉處理去除細胞，抽樣進行HE染色檢測。在手術(shù)顯微鏡下，用10ul的微量進樣

6、器將PKH26標記好的BMSCs(濃度為107個/ml)細胞懸液注射到去細胞神經(jīng)支架內(nèi)，構(gòu)建成組織工程神經(jīng)，置入含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 分別于3d、5d、7d、14d各取3份樣本，行冰凍切片，DAPI復(fù)染細胞核，熒光顯微鏡下觀察在體外培養(yǎng)的環(huán)境下BMSCs在支架內(nèi)存活、遷移的情況。
　　 1.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)植入示蹤實驗。
　　 取體重為200g左右的雌

7、性Wistar大鼠12只，10％水合氯醛(0.03ml/kg體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，暴露一側(cè)坐骨神經(jīng)并切除一段，造成15mm長的神經(jīng)缺損，然后用構(gòu)建好的組織工程神經(jīng)移植修復(fù)。分別于術(shù)后1周、4周、6周、8周各取3只大鼠，取出植入組織工程神經(jīng)，行冰凍切片，DAPI復(fù)染細胞核，熒光顯微鏡下觀察BMSCs在體內(nèi)存活的情況。
　　 2.骨髓基質(zhì)干細胞復(fù)合去細胞神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損及其機制的初步研究。
　　 2.1 大鼠BMSC

8、s的體外培養(yǎng)及PKH26標記。
　　 取體重為100g左右的雄性Wistar大鼠9只，用全骨髓貼壁的方法進行BMSCs原代培養(yǎng)，待細胞生長融合達90％即行1∶3傳代培養(yǎng)，每只大鼠各取一份細胞標本，用胰酶分別消化收集第1代、第3代、和第6代的BMSCs于EP管中，行熒光定量RT-PCR測定NGF-mRNA和GDNF-mRNA表達。取第3代BMSCs，用熒光染料PKH26行體外標記。
　　 2.2 同種異體去細胞神經(jīng)支架制備

9、及組織工程神經(jīng)的體外構(gòu)建。
　　 取體重為250-300g的雌性Wistar大鼠30只，無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)約2.5cm長，剝除神經(jīng)周圍結(jié)締組織，依次用蒸餾水、3％TritonX-100和4％脫氧膽酸鈉處理去除細胞。在手術(shù)顯微鏡下，用10ul的微量進樣器將準備好的第3代的BMSCs(濃度為107/ml)細胞懸液注射到支架內(nèi)，置入含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天備用。
　　 2.3 大

10、鼠BMSCs復(fù)合去細胞神經(jīng)支架的體內(nèi)植入實驗。
　　 取體重為200g左右的雌性Wistar大鼠50只，隨機分為3組，A組為BMSCs+去細胞神經(jīng)支架組(BMSCs-laden組)共20只，B組為自體神經(jīng)組(autograft組)共15只，C組為去細胞神經(jīng)支架組(non-cell-laden組)共15只。10％水合氯醛腹腔麻醉，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，切斷神經(jīng)造成約15mm長的缺損，分別用以上三種神經(jīng)移植物橋接缺損。
　　 2

11、.4 術(shù)后大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)檢測。
　　 在術(shù)前及術(shù)后2、4、6周進行實驗動物的步態(tài)分析，計算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，繪制曲線圖。術(shù)后6周檢測神經(jīng)移植體動作電位的刺激閾強度和最大振幅并計算傳導(dǎo)速度。取雙側(cè)腓腸肌，稱取濕重，計算濕重比，行石蠟包埋切片，Masson染色比較肌肉纖維和膠原纖維比例。
　　 2.5 大鼠坐骨神經(jīng)再生組織學(xué)檢測。
　　 術(shù)后6周，取神經(jīng)移植體中段的組織學(xué)切片進行透射電鏡觀察、甲苯胺藍染色并作圖

12、象分析，測量神經(jīng)組織百分比、有髓神經(jīng)纖維密度、軸突直徑和髓鞘厚度。另外，用組織免疫熒光方法檢測神經(jīng)絲蛋白(NF)和髓鞘堿性蛋白(MBP)的表達。
　　 2.6 檢測BMSCs在體內(nèi)存活和向許旺細胞分化的情況。
　　 術(shù)后6周取出神經(jīng)移植物，行冰凍切片，用DAPI復(fù)染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察有無PKH26標記的細胞存活，同時行S-100、GFAP組織免疫熒光檢測干細胞向許旺細胞分化的情況。
　　 2.7 檢測神經(jīng)

13、移植體內(nèi)SRY-DNA及NGF-mRNA和GDNF-mRNA。
　　 取新鮮神經(jīng)移植體，提取總DNA和RNA，行實時熒光定量PCR檢測SRY-DNA的表達；行實時熒光定量RT-PCR檢測NGF-mRNA和GDNF-mRNA的表達。
　　 2.8 L4、L5段脊髓及背根神經(jīng)節(jié)組織學(xué)檢測。
　　 取L4、L5段脊髓及背根神經(jīng)節(jié)，用焦油紫行尼氏體染色，測量比較各組間運動神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元的平均數(shù)量、直徑和面積。

14、　　 結(jié)論:
　　 1.PKH26熒光染料能有效地標記BMSCs，結(jié)合DAPI復(fù)染的方法，可用于組織工程神經(jīng)種子細胞體內(nèi)示蹤的研究。
　　 2.骨髓基質(zhì)干細胞復(fù)合去細胞神經(jīng)支架植入體內(nèi)后，在周圍神經(jīng)再生微環(huán)境下能存活6周，并能分化為類許旺細胞。
　　 3.體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞能夠表達一定量的NGF-mRNA和GDNF-mRNA，復(fù)合同種異體去細胞神經(jīng)植入體內(nèi)6周后能存活，并且促進神經(jīng)移植體內(nèi)NGF-mRNA