GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞橋接修復(fù)坐骨神經(jīng)長(zhǎng)距離缺損的研究.pdf

1、研究背景:
　　 周圍神經(jīng)損傷(PNI)是臨床常見(jiàn)的損傷。近年來(lái),隨著現(xiàn)代交通事業(yè)以及工業(yè)建筑事業(yè)發(fā)展進(jìn)程的不斷推進(jìn),PNI的發(fā)病率日益上升。在美國(guó),臨床上每年有5萬(wàn)甚至更多的周圍神經(jīng)缺損病例發(fā)生;我國(guó)周圍神經(jīng)損傷病例每年新增60萬(wàn)-90萬(wàn)例[1]。同時(shí),相較于其它組織,神經(jīng)元在成熟生長(zhǎng)階段不具備分裂和復(fù)制功能,發(fā)生損傷后,若不采取積極有效的措施進(jìn)行救治,極易導(dǎo)致?lián)p傷處損害甚至喪失肌肉功能、感覺(jué)功能,進(jìn)而造成終生殘疾[2]。不僅

2、對(duì)人們的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響,同時(shí)也威脅著人們的身心健康。目前周圍神經(jīng)缺損的治療策略,是依據(jù)周圍神經(jīng)損傷再生的理論,通過(guò)提供一個(gè)神經(jīng)纖維再生通道、給予必要的支持細(xì)胞以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子等方法,促進(jìn)神經(jīng)再生的,沒(méi)能解決神經(jīng)快速到達(dá)效應(yīng)器、感受器的問(wèn)題。鑒于此,“橋接神經(jīng)元修復(fù)周圍神經(jīng)缺損”的設(shè)想被提出,即通過(guò)神經(jīng)元接力的方法,加快神經(jīng)到達(dá)效應(yīng)器、感受器的時(shí)間,減少效應(yīng)器、感受器病變程度,提高神經(jīng)損傷修復(fù)的效果。
　　 目的:
　

3、　 1、抽取家兔骨髓,進(jìn)行培養(yǎng),選取家兔骨髓源性神經(jīng)組織定向干細(xì)胞(NTCSC)為種子細(xì)胞。并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定方法對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行鑒定,確定該細(xì)胞來(lái)源于神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2、NTCSC的分離和鑒定,培養(yǎng)后獲取第三代NTCSC。并對(duì)其進(jìn)行攜帶GFP的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,獲取攜帶GFP的NTCSC。
　　 3、誘導(dǎo)攜帶GFP的NTCSC向神經(jīng)元細(xì)胞分化,獲取滿足移植條件的干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞。
　　 4、制備脫

4、細(xì)胞神經(jīng)支架,構(gòu)建神經(jīng)再生室。
　　 5、在神經(jīng)支架上種植干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體外構(gòu)建。
　　 6、實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體外培養(yǎng),對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞的變化規(guī)律、神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的電生理特性等進(jìn)行觀察。
　　 7、實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的在體研究,觀察GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞在受損周圍神經(jīng)中的存活狀況,以及神經(jīng)元性組織工程神經(jīng)在修復(fù)受損周圍神經(jīng)中發(fā)

5、揮的效果。
　　 方法:
　　 1、選取3月齡家兔為材料對(duì)象,于其脛骨平臺(tái)下抽取2～3ml骨髓。培養(yǎng)骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。以該骨髓神經(jīng)組織干細(xì)胞為種子細(xì)胞。
　　 2、骨髓神經(jīng)組織干細(xì)胞混合液進(jìn)行離心、培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合,進(jìn)行傳代,獲取第三代NTCSC。然后在第三代NTCSC混合中,滴加1.5×109pfu/L攜帶GFP基因慢病毒表達(dá)載體的病毒懸液10μL,對(duì)第三代NTCSC進(jìn)行轉(zhuǎn)染,獲取,攜帶GFP

6、的NTCSC。
　　 3、在攜帶GFP的NTCSC培養(yǎng)基中分別加入誘導(dǎo)劑Soniehedgehog(Shh,500ng/mL)/Retino Acid(RA,2000nmol/L)即RA+SHH,誘導(dǎo)種子細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化。
　　 4、采用10 cm長(zhǎng)的醫(yī)用硅膠管為神經(jīng)支架材料,將其放入-80℃冰箱中進(jìn)行冷凍,待其干燥成形后,制成干燥成形的膠原-殼聚糖支架材料。然后,將兔坐骨神經(jīng)剪除長(zhǎng)約0.5cm一段,使其自然回縮

7、,形成1.5cm缺損,并將無(wú)菌硅膠管縫接于神經(jīng)缺損處的兩斷端,制作成動(dòng)物模型。
　　 5、制備實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)1.5cm缺損模型20只及自體神經(jīng)移植模型10只。分別進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為3組,每組10只。
　　 實(shí)驗(yàn)1組:(空支架移植組):將實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)切除0.5cm,使其自然回縮,形成1.5cm長(zhǎng)的缺損,將細(xì)胞支架與坐骨神經(jīng)兩斷端縫合,用微量注射器沿縱軸伸入其中,采用散點(diǎn)注射法將細(xì)胞懸液植入脫細(xì)胞神經(jīng)支架中,以

8、1.5mm的距離為沒(méi)點(diǎn)間距,共11個(gè)注射點(diǎn),注入無(wú)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液160μL。
　　 實(shí)驗(yàn)2組:(細(xì)胞支架組):將107細(xì)胞數(shù)/mL濃度的NTCSC源性神經(jīng)細(xì)胞懸液微量注射器抽取細(xì)胞懸液160μL,方法同上。
　　 實(shí)驗(yàn)3組:(神經(jīng)移植組):將實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)截?cái)嗉s1.5cm,將近端與遠(yuǎn)端調(diào)轉(zhuǎn)后縫合。
　　 對(duì)上述構(gòu)建的神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體進(jìn)行體外培養(yǎng),對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞的變化規(guī)律、神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的電生理

9、特性等進(jìn)行觀察。
　　 6、在神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體內(nèi)研究上,細(xì)胞移植4、8、12、16周時(shí)進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)觀測(cè)、肌力評(píng)估,肌電圖等檢測(cè)。觀察GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞在受損周圍神經(jīng)中的存活狀況,研究“橋接神經(jīng)元修復(fù)周圍神經(jīng)缺損”的可行性,以及神經(jīng)元性組織工程神經(jīng)在修復(fù)受損周圍神經(jīng)中發(fā)揮的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1、移植細(xì)胞在脫細(xì)胞神經(jīng)支架內(nèi)生長(zhǎng)、分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:神經(jīng)元細(xì)胞組骨髓神經(jīng)組織定向干

10、細(xì)胞源性神經(jīng)細(xì)胞能夠成功的種植到支架上,且較為均勻的呈片狀分布,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。細(xì)胞膜光滑完整、胞漿豐富,核輪廓清晰。從而表明:在脫細(xì)胞神經(jīng)支架中實(shí)現(xiàn)骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的移植,種子細(xì)胞能夠得到較好的定居、遷移和植入。且免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:在脫細(xì)胞神經(jīng)支架上,Nestin陽(yáng)性細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了成功的種植,并可以在一定時(shí)間內(nèi)能夠保持自我更新和神經(jīng)前體細(xì)胞的穩(wěn)定性。同時(shí),移植細(xì)胞在支架內(nèi)的電鏡觀察結(jié)果顯示:移植細(xì)胞在支架內(nèi)具有一定的功能結(jié)構(gòu)。

11、移植細(xì)胞在支架內(nèi)的電生理檢測(cè)結(jié)果:神經(jīng)元細(xì)胞組神經(jīng)移植體在體外培養(yǎng)8周時(shí)具有電生理特性。總體表明:移植細(xì)胞在脫細(xì)胞神經(jīng)支架內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)成功的移植,且生長(zhǎng)、分化狀態(tài)良好。
　　 2、移植細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)兔能夠具備較好的行走功能,肌肉收縮有力,神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的傳導(dǎo)速度較快,實(shí)驗(yàn)兔的肌肉蛋白質(zhì)含量較高,且HRP逆行示蹤實(shí)驗(yàn)、免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果以及透射電鏡檢測(cè)結(jié)果均表明植入的NTCSC源性的神經(jīng)元可以在實(shí)驗(yàn)