微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬通過以海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（Algin-Polylysine-Algin，APA）成分構(gòu)成的微膠囊包裹大鼠坐骨神經(jīng)組織，以化學(xué)萃取獲得脫細(xì)胞的犬同種異體神經(jīng)，將二者聯(lián)合移植修復(fù)不同長度的犬坐骨神經(jīng)缺損，研究針對(duì)“再細(xì)胞化”的脫細(xì)胞神經(jīng)在神經(jīng)修復(fù)再生中的作用和意義，為探索自體神經(jīng)移植的替代方案方法提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分犬脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)的構(gòu)建。 目的：構(gòu)建犬脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)。 方法：健

2、康雜種犬10只，體重在10kg-15kg之間，健康雌性Wistar大鼠5只，體重在220-250g之間。采用Triton-Ⅹ100和脫氧膽酸鈉通過化學(xué)萃取方法來處理新鮮犬坐骨神經(jīng)。鈷-60γ射線輻照消毒滅菌后，通過大體觀察、光鏡觀察、掃描電鏡觀察評(píng)價(jià)其組織形態(tài).大鼠行脫細(xì)胞神經(jīng)背部肌肉包埋實(shí)驗(yàn)，術(shù)后1周取出脫細(xì)胞神經(jīng)作石蠟切片，HE染色；評(píng)價(jià)生物相容性。 結(jié)果：經(jīng)過化學(xué)萃取后支架呈半透明狀，較新鮮神經(jīng)略有收縮。光鏡觀察、掃描電鏡

3、觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞成分殘留，僅剩下較完整的基底膜管道。肌肉包埋實(shí)驗(yàn)后1周支架周圍有輕微的炎癥反應(yīng)，周圍肌肉無明顯壞死。 第二部分微囊化大鼠神經(jīng)組織的制備及其生物活性的研究。 目的：使用APA材料制備微囊化大鼠神經(jīng)組織，并評(píng)價(jià)其移植體內(nèi)后的生物活性， 方法：健康雌性Wistar大鼠5只，體重在220-250g之間，健康雄性昆明鼠20只，體重20～25g.切取大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)在胰酶消化下形成細(xì)胞組織塊，使用APA

4、材料利用微囊靜電發(fā)生器將神經(jīng)組織包裹，制成微囊化神經(jīng)組織，采用注射的方法將一定數(shù)量的微囊化神經(jīng)組織移植到小鼠的腹腔，術(shù)后6周回收微囊，計(jì)算回收率，接著對(duì)其體外培養(yǎng)3天，采用四唑鹽（MTT）法、ELISA法檢測(cè)NGF含量以及對(duì)回收微囊內(nèi)神經(jīng)組織進(jìn)行再培養(yǎng)觀察其生長情況等方法，綜合評(píng)價(jià)其活性。 結(jié)果：微囊化神經(jīng)組織移植體內(nèi)6周后外型基本保持完整，回收率位于80～90％，MTT法、ELISA法均檢測(cè)出囊內(nèi)神經(jīng)組織細(xì)胞仍有活性，將微囊內(nèi)

5、神經(jīng)組織再培養(yǎng)時(shí)觀察到細(xì)胞仍可貼壁，生長良好。 第三部分微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)短段缺損后靶肌肉變化的研究。 目的：了解微囊化神經(jīng)組織細(xì)胞與脫細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植橋接犬坐骨神經(jīng)3cm缺損后腓腸肌的相應(yīng)變化， 方法：將犬24只隨機(jī)分為A、B、C3組，每組8只。所有動(dòng)物均人為手術(shù)造成單側(cè)坐骨神經(jīng)3cm缺損，A組：脫細(xì)胞神經(jīng)輔加微囊化神經(jīng)移植修復(fù)缺損；B組：單純脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)缺損；C組：自體神經(jīng)切

6、斷后原位倒置修復(fù)，術(shù)后定期觀察犬的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，并于術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月行移植段神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)，并切取雙側(cè)腓腸肌行琥珀酸脫氫酶（SDH）、突觸素、運(yùn)動(dòng)終板染色，同時(shí)取脫細(xì)胞神經(jīng)移植遠(yuǎn)端吻合口以遠(yuǎn)1cm處的神經(jīng)行HE染色、MASSON染色、固藍(lán)染色、S-100免疫組化染色、NF-200免疫組化染色等形態(tài)學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析、無脫失。術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及電生理檢測(cè)方面，A、C組間差別不大，但明顯

7、優(yōu)于B組.圖象分析表明A組在術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月腓腸肌SDH光密度、肌纖維截面積、突觸素及膽堿脂酶光密度和面積方面明顯優(yōu)于B組，而與C組無明顯差別，脫細(xì)胞神經(jīng)移植段吻合口遠(yuǎn)端神經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)符合靶肌肉檢測(cè)結(jié)論。 第四部分微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)中長段缺損后靶肌肉的研究。 目的：了解微囊化神經(jīng)組織細(xì)胞與脫細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植橋接犬坐骨神經(jīng)6cm缺損后腓腸肌的相應(yīng)變化。 方法：將犬24只隨機(jī)分為D、E

8、、F3組，每組8只。所有動(dòng)物均人為手術(shù)造成單側(cè)坐骨神經(jīng)6cm缺損，D組：脫細(xì)胞神經(jīng)輔加微囊化神經(jīng)移植修復(fù)缺損；B組：單純脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)缺損；C組：自體神經(jīng)切斷后原位倒置修復(fù)。術(shù)后定期觀察犬的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，于術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月行移植段神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)，并切取雙側(cè)腓腸肌行琥珀酸脫氫酶（SDH）、突觸素、膽堿脂酶運(yùn)動(dòng)終板染色，同時(shí)取脫細(xì)胞神經(jīng)移植遠(yuǎn)端吻合口以遠(yuǎn)1cm處的神經(jīng)行HE染色、MASSON染色、固藍(lán)染色、S-100免疫組

9、化染色、NF-200免疫組化染色等形態(tài)學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析、無脫失。術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況及電生理檢測(cè)，D、E、F組較術(shù)前均有明顯差距，D、F組間差別不大，相對(duì)E組而言恢復(fù)效果要好，圖象分析表明D組在術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月腓腸肌SDH光密度、肌纖維截面積、突觸素及膽堿脂酶光密度和面積方面明顯優(yōu)于E組，而與F組無明顯差別，脫細(xì)胞神經(jīng)移植段吻合口遠(yuǎn)端神經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)符合靶肌肉檢測(cè)結(jié)論。 結(jié)論：

10、 [1]通過化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法制備的脫細(xì)胞神經(jīng)具有正常神經(jīng)的天然孔隙和三維空間結(jié)構(gòu)，材料的免疫原性基本上被去除，具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性。 [2]微囊化神經(jīng)組織可在體內(nèi)保持活性至少6周，囊內(nèi)的細(xì)胞可正常生存并保持增殖功能，將其移植至體內(nèi)以達(dá)到對(duì)脫細(xì)胞神經(jīng)“再細(xì)胞化”是安全可行的. [3]微囊化神經(jīng)組織與脫細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植修復(fù)短段（3cm）神經(jīng)缺損后，在較短時(shí)間內(nèi)大量神經(jīng)纖維重新支配靶器官，使腓腸肌萎縮明顯減弱，效

11、果明顯優(yōu)于單純脫細(xì)胞神經(jīng)移植，與自體神經(jīng)移植效果無顯著差異性，單純脫細(xì)胞神經(jīng)移植效果似也在可勉強(qiáng)接受的水平，至于遠(yuǎn)期效果比較是否存在差異以及更長距離的再細(xì)胞化的必要性等問題仍需進(jìn)一步深入研究. [4]微囊化神經(jīng)組織與脫細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植修復(fù)中長段（6cm）神經(jīng)缺損后，在一定時(shí)間內(nèi)相當(dāng)數(shù)量的神經(jīng)纖維重新支配靶器官，使腓腸肌萎縮減弱得到一定程度的緩解，與自體神經(jīng)移植效果無明顯差異，盡管較之正常水平仍有不小的差距，但其效果明顯優(yōu)于單純脫