新型組織工程神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建及其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷在臨床工作中比較常見，在外傷患者中，約有2.8％的病例伴有不同程度的周圍神經(jīng)損傷。最近興起的組織工程神經(jīng)被認(rèn)為是有希望的替代方案，應(yīng)用組織工程的方法構(gòu)建神經(jīng)移植物，能夠很好的解決上述的問題。對(duì)于理想的組織工程神經(jīng)，要求其具有良好的生物相容性，生物降解性，并且能夠引導(dǎo)和促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生。
　　在本文中我們先后構(gòu)建了三種人工神經(jīng)應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。分別為PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料，PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料及施

2、萬細(xì)胞和PLGA復(fù)合有序膠原蛋白支架構(gòu)建的人工神經(jīng)。
　　在我們用到的材料中自聚合肽納米材料(SAPNS)是最近興起的生物材料，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程中。與傳統(tǒng)材料相比，其纖維構(gòu)成和孔徑能夠更好的模擬細(xì)胞外基質(zhì)，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。PLGA全稱是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lacti c-co-glycolicacid))，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜性，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。

3、　　目的:
　　通過以上材料的互相結(jié)合，我們構(gòu)建了三種組織工程神經(jīng)，并檢測(cè)了其對(duì)神經(jīng)損傷再生的促進(jìn)作用。
　　方法：
　　1.人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備
　　1.1 PLGA管的制備:將PLGA顆粒溶于三氯甲烷中攪拌24h至均勻，制成5％的PLGA溶液，其中PLA∶PGA為85∶15。將相同于溶液中溶質(zhì)質(zhì)量的氯化鈉顆粒(96-75μm)加入到溶液中攪拌24h后將已經(jīng)配制好的溶液漿料迅速倒入聚四氟乙烯模具中成型為管狀體并置

4、于冷凍干燥機(jī)中凍干2h，將成型的導(dǎo)管用蒸餾水洗6次去除材料中的氯化鈉顆粒，然后再用DMEM/F12培養(yǎng)液中沖洗3次，備用。
　　1.2 施萬細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定:取兩周齡大鼠，截取坐骨神經(jīng)，用反復(fù)植塊法培養(yǎng)純化施萬細(xì)胞。
　　1.3 膠原蛋白有序支架材料的制備:提取大鼠鼠尾膠原，通過冷凍干燥和物理拉伸制備內(nèi)部含有有序細(xì)微管道的線性膠原支架。
　　1.4 人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備:
　　PLGA+SAPNS:PLGA管內(nèi)填充

5、20μ l SAPNS，然后在DMEM/F12培養(yǎng)液中浸泡30分鐘，使自聚合肽聚合成為凝膠狀。
　　PLGA+SAPNS+SCs:將2.5×105個(gè)SCs混入20μl SAPNS，然后填充到PLGA管內(nèi)，DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡30min，使自聚合肽聚合成為凝膠狀。
　　PLGA+collagen:將上述制備的膠原支架填充到到PLGA管內(nèi)，DMEM/F12培養(yǎng)液中浸泡30分鐘，備用。
　　2.大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型制備

6、及人工神經(jīng)導(dǎo)管移植:暴露大鼠坐骨神經(jīng)后切除部分神經(jīng)造成10mm的缺損，用上述構(gòu)建的人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行移植修復(fù)。另設(shè)神經(jīng)移植陽性對(duì)照組(peripheral nerve，PN)、單純?nèi)睋p無移植的陰性對(duì)照組(non graft，NG)和假手術(shù)組(sham)。PN的移植物為從同種SD大鼠所取下的10mm坐骨神經(jīng)。NG只做神經(jīng)缺損，不做修復(fù)處理。sham僅暴露坐骨神經(jīng)但不做損傷。
　　3.行為學(xué)功能檢測(cè):使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在100cm長(zhǎng)，寬10cm

7、的長(zhǎng)方體通道中行走，將其前腳掌涂無毒染料，訓(xùn)練其走窄跑道。動(dòng)物熟練行走后進(jìn)行測(cè)試三次。首先，我們分析了損傷側(cè)后肢著地方式，然后在得到的完整足印上測(cè)量前后腳掌掌心距和腳掌與動(dòng)物前進(jìn)方向的夾角。
　　4.神經(jīng)電生理檢測(cè):大鼠麻醉后重新暴露坐骨神經(jīng)，將刺激電極和參考電極分別置于移植物近側(cè)端的宿主神經(jīng)干，記錄電極置于同側(cè)腳掌掌心。然后記錄復(fù)合肌誘發(fā)動(dòng)作電位（compound muscle action potential，CMAP）。從所

8、獲得的電生理CMAP圖形測(cè)量其神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期(latency)和復(fù)合動(dòng)作電位的波幅(amplitude)。
　　5.熒光金逆行示蹤檢測(cè):電生理檢測(cè)后，通過顯微注射將2μl1％的熒光金注射于移植物遠(yuǎn)端5mm處。注射后7d，處死動(dòng)物，觀察標(biāo)記結(jié)果。
　　6.組織收集:注射熒光金7d后，麻醉動(dòng)物，取出雙側(cè)腓腸肌稱重，計(jì)算濕重比。0.1M PBS和多聚甲醛灌注，取材收集坐骨神經(jīng)和L5脊髓節(jié)段。部分樣本用2.5％戊二醛加2％多聚甲醛固

9、定以備透射電子顯微鏡檢測(cè)，4％的多聚甲醛固定以備冰凍切片和免疫熒光染色。
　　7.免疫熒光檢測(cè):用于免疫熒光染色的樣品經(jīng)過4％多聚甲醛固定24 h后梯度蔗糖脫水，OCT包埋后冰凍切片，厚度20μ m，切片保存在-20℃待用。在每個(gè)組織的切片中，間隔10片取出l片，進(jìn)行NF-200/MBP免疫組化雙染色檢測(cè)軸突和髓鞘，熒光顯微鏡觀察和拍照。
　　8.透射電鏡觀察:取移植物中段1mm標(biāo)本，2.5％戊二醛和2％多聚甲醛固定24 h

10、后，樣品經(jīng)過梯度丙酮脫水，在1％OsO4中4℃處理2h。然后將樣品用樹脂包埋后進(jìn)行超薄切片，2％醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染，用透射電子顯微鏡觀察髓鞘和神經(jīng)纖維生長(zhǎng)情況并拍照，測(cè)量分析各組差異。
　　9.腓腸肌組織學(xué)檢測(cè):取腓腸肌中段5mm×2mm×2 mm組織塊浸入多聚甲醛固定過夜，梯度蔗糖脫水，OCT包埋劑包埋后進(jìn)行冰凍切片，厚度l0μm。隔10張取一張進(jìn)行蘇木素染色，光鏡觀察，并采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)量放大2

11、0倍視野下各組腓腸肌纖維面積。
　　10.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元定量分析:脊髓L5節(jié)段冰凍切片，厚度10μ m。每隔10片取1片進(jìn)行熒光Nissl染色標(biāo)記存活神經(jīng)元。統(tǒng)計(jì)熒光金標(biāo)記的再生神經(jīng)元占存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的比例，同時(shí)根據(jù)損傷側(cè)和正常側(cè)神經(jīng)元的比值，計(jì)算神經(jīng)元存活的比例。
　　11.運(yùn)動(dòng)終板檢測(cè):取固定后的中段腓腸肌，每個(gè)組織分別進(jìn)行冰凍切片縱切，厚度10μ m，縱切片用α-銀環(huán)蛇毒素(α-BTX)染色標(biāo)記運(yùn)動(dòng)終板。染色結(jié)果顯微觀察并

12、拍照，每個(gè)標(biāo)本選取六個(gè)不重疊的視野，用Image Pro Plus統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)終板的面積和腓腸肌的肌纖維橫切面積。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)檢測(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù):與單純損傷無移植的NG相比，人工神經(jīng)或周圍神經(jīng)移植后大鼠損傷側(cè)后肢行為學(xué)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)均有較顯著的改善。提示坐骨神經(jīng)有不同程度的再生使得靶區(qū)肌組織能在神經(jīng)支配下恢復(fù)部分運(yùn)動(dòng)功能。
　　2.神經(jīng)電生理檢測(cè)損傷坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)功能:通過電生理波形分析，可見坐骨神經(jīng)缺損后C

13、MAP波形基本消失，神經(jīng)導(dǎo)管或周圍神經(jīng)移植后CMAP有不同程度的恢復(fù)。其中上述人工神經(jīng)導(dǎo)管移植組的神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期(latency)和復(fù)合動(dòng)作電位的波幅(amplitude)的數(shù)值介于PLGA空套管組和PN之間。提示人工神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)功能有一定的效果。
　　3.軸突的再生情況:標(biāo)本取材后可見人工神經(jīng)導(dǎo)管或周圍神經(jīng)移植組的宿主神經(jīng)干與移植物之間沒有明顯的瘢痕組織出現(xiàn)。將縱切片標(biāo)本做NF-200免疫組化后可以看到在移植區(qū)有大量N

14、F-200陽性的再生軸突，軸突排列比較規(guī)則，基本平行于神經(jīng)長(zhǎng)軸，大部分軸突通過移植區(qū)進(jìn)入到尾側(cè)神經(jīng)干。在NF-200免疫組化染色的橫切片上可以看到，再生軸突較均勻分布于整個(gè)移植的管道。
　　4.再生軸突的髓鞘化:NF-200和MBP免疫熒光雙染或透射電鏡結(jié)果可見，在各組移植區(qū)橫切片均可見不同程度的NF-200陽性軸突及其周圍包繞的MBP陽性髓鞘。相對(duì)而言，三種人工神經(jīng)導(dǎo)管移植區(qū)內(nèi)的軸突密度和直徑、軸突髓鞘化比例，以及髓鞘的厚度仍較

15、顯著低于假手術(shù)組和周圍神經(jīng)移植組，但顯著高于PLGA空套管組。
　　5.神經(jīng)元的存活和再生:脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)出的軸突參與了坐骨神經(jīng)組成，所以坐骨神經(jīng)橫斷可導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元的損傷。通過熒光Nissl染色顯示神經(jīng)元并將損傷側(cè)與對(duì)照側(cè)比較，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率在各移植組之間沒有顯著性差異。同時(shí)比較熒光金陽性標(biāo)記的再生神經(jīng)元占存活神經(jīng)元的比例，提示人工神經(jīng)導(dǎo)管移植能顯著提高再生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的比例，但與周圍神經(jīng)移植組間仍有差異。
　

16、　6.腓腸肌萎縮情況:坐骨神經(jīng)缺損可導(dǎo)致其所支配的腓腸肌明顯萎縮，肌纖維脂肪變性，在單純損傷組由于沒有有效的治療，肌肉萎縮的情況最明顯，而在各個(gè)治療組，萎縮程度有著明顯的改善。統(tǒng)計(jì)肌纖維的橫切面積和腓腸肌的濕重比，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.運(yùn)動(dòng)終板的形態(tài)分析:用α-BTX標(biāo)記神經(jīng)肌肉接觸位置的運(yùn)動(dòng)終板，從運(yùn)動(dòng)終板的面積可以看出，各組的運(yùn)動(dòng)終板面積都有不同程度的下降，均低于假手術(shù)組。運(yùn)動(dòng)終板面積減小最明顯的是單純損傷，其次是

17、三種人工神經(jīng)組，周圍神經(jīng)組與正常動(dòng)物的差異不明顯。
　　在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了三種新型的組織工程人工神經(jīng)材料，它是由PLGA材料構(gòu)成的導(dǎo)管支撐，內(nèi)部分別填充了自聚合肽納米材料(SAPNS)、混合施萬細(xì)胞的SAPNS和線性有序膠原支架。利用大鼠坐骨神經(jīng)缺損10mm的損傷模型檢測(cè)其促周圍神經(jīng)再生的效果，同時(shí)利用假手術(shù)、同源周圍神經(jīng)、PLGA空導(dǎo)管和單純損傷等分別作為陽性或陰性對(duì)照。經(jīng)過電生理、行為學(xué)、組織學(xué)和神經(jīng)束路示蹤等檢測(cè)手段

18、，評(píng)價(jià)缺損神經(jīng)的軸突再生、髓鞘化、神經(jīng)傳導(dǎo)以及后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)等情況。
　　結(jié)論：
　　綜合各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)可見，本課題所構(gòu)建的三種新型人工神經(jīng)導(dǎo)管均能較好地橋接缺損的周圍神經(jīng)，可促進(jìn)軸突再生及髓鞘化，同時(shí)神經(jīng)傳導(dǎo)功能及靶區(qū)運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)。同時(shí)，本研究結(jié)果也提示，上述導(dǎo)管促神經(jīng)再生的效果與周圍神經(jīng)移植組相比還有差距。本課題組將根據(jù)本研究的結(jié)果和提示，對(duì)所構(gòu)建的人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)一步完善和改進(jìn)，不斷提高周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的效