組織工程化神經(jīng)的體外構(gòu)建及其修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、第一部分:組織工程化神經(jīng)的體外構(gòu)建
　　目的：
　　采用背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元、施萬細(xì)胞與生物材料支架在體外共培養(yǎng)，構(gòu)建成一種類似神經(jīng)組織的組織工程化神經(jīng)，從而為更好地模擬自體神經(jīng)移植修復(fù)神經(jīng)缺損提供新技術(shù)。
　　方法：
　　1.取新生1d SD大鼠坐骨神經(jīng)，通過反復(fù)植塊法獲取高純度的施萬細(xì)胞；
　　2.施萬細(xì)胞注入絲素蛋白神經(jīng)移植物管腔內(nèi)，于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)7 d后，兩端各植入胚胎14.5-16.5d

2、 SD大鼠L4-6 DRGs；
　　3.培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立施萬細(xì)胞/背根神經(jīng)節(jié)(DRG)共培養(yǎng)體系，體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)；
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察施萬細(xì)胞、DRG與絲素蛋白神經(jīng)移植物共培養(yǎng)2w的情況；
　　5.掃描電鏡分別于共培養(yǎng)2w、3w和4w后，觀察絲管內(nèi)細(xì)胞生長情況；
　　6.透射電鏡觀察共培養(yǎng)3w后，絲管內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和髓鞘形成情況。
　　結(jié)果：
　　1.建立了施萬細(xì)胞/背根神經(jīng)節(jié)(DRG

3、)/絲素蛋白神經(jīng)移植物共培養(yǎng)體系，體外成功構(gòu)建組織工程化神經(jīng)；
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察施萬細(xì)胞、DRG與絲素蛋白神經(jīng)移植物共培養(yǎng)2w后， S100陽性施萬細(xì)胞與NF陽性DRG神經(jīng)突起沿著絲素纖維，呈條帶狀縱向平行生長；
　　3.掃描電鏡觀察結(jié)果表明，施萬細(xì)胞與DRG神經(jīng)突起呈縱向平行生長，共培養(yǎng)4w后有類似基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成；
　　4.透射電鏡結(jié)果顯示，施萬細(xì)胞、DRG與絲素蛋白神經(jīng)移植物共培養(yǎng)3w后，有髓鞘的形成。

4、
　　結(jié)論：
　　采用施萬細(xì)胞、DRG與絲素蛋白神經(jīng)移植物體外聯(lián)合培養(yǎng)，可構(gòu)建成具有神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)的組織工程化神經(jīng)。
　　第二部分:組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究
　　目的
　　采用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和電生理學(xué)等方法，檢測組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的功能效果，為進(jìn)一步完善組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建提供參考。
　　方法
　　1.將體外構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)橋接修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損；

5、r>　　2.術(shù)后12w，檢測再生神經(jīng)干動作電位，并計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度；
　　3.術(shù)后4w，6w，8w，10w和12w，測量并計算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)；
　　4.術(shù)后4w、12w，采用免疫組織化學(xué)方法觀察再生神經(jīng)干的生長情況；
　　5.術(shù)后12w，透射電鏡觀察再生髓鞘的厚度和髓鞘的板層數(shù)；
　　6.術(shù)后12w，測量并計算靶肌橫截肌纖維面積和單位面積膠原纖維百分?jǐn)?shù)。
　　7.術(shù)后4w，Western blot檢測再生

6、神經(jīng)干中細(xì)胞粘附分子N-cadherin和周圍髓鞘蛋白22（PMP22）的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，術(shù)后12周，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）坐骨神經(jīng)干復(fù)合肌動作電位（CMAP）與陽性對照的自體神經(jīng)組（Autograft）相比沒有顯著差異,均明顯優(yōu)于絲素導(dǎo)管組(Scaffold)（P<0.05）。組織工程化神經(jīng)組（nTENG）的神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MCV）與自體神經(jīng)組（Autograft

7、）相比沒有顯著差異。
　　2.術(shù)后12 w，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）與陽性對照的自體神經(jīng)組（Autograft）相比無顯著差異，均明顯優(yōu)于絲素導(dǎo)管組(Scaffold)（P<0.05）。
　　3.術(shù)后4w，免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）與陽性對照的自體神經(jīng)組（Autograft）均有成束的再生神經(jīng)纖維形成；術(shù)后12w,再生神經(jīng)纖維數(shù)量顯著增加。
　　4.術(shù)后術(shù)后4w

8、和12 w，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）與陽性對照的自體神經(jīng)組（Autograft）再生髓鞘的厚度和髓鞘的板層數(shù)與對側(cè)非手術(shù)側(cè)的比率，均顯著高于絲素導(dǎo)管組(Scaffold)（P<0.05）。
　　5.術(shù)后12 w，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）與陽性對照的自體神經(jīng)組（Autograft）的靶肌纖維的橫截面積，顯著高于絲素導(dǎo)管組(Scaffold)（P<0.05）；而膠原纖維占肌纖維的百分率，均顯著低于絲素導(dǎo)管組(Scaffol

9、d)（P<0.05）。
　　6.術(shù)后4w，組織工程化神經(jīng)組（nTENG）與自體神經(jīng)組（Autograft）N-cadherin的表達(dá)水平顯著高于絲素導(dǎo)管組（P<0.05）；而PMP22的表達(dá)水平從2w開始顯著高于絲素導(dǎo)管組（P<0.01）。
　　結(jié)論
　　1.組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，復(fù)合肌動作電位、運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度、髓鞘厚度和板層數(shù)等功能指標(biāo)均優(yōu)于絲素導(dǎo)管組，與自體神經(jīng)組無顯著差異，組織工程化神經(jīng)修

10、復(fù)周圍神經(jīng)缺損明顯促進(jìn)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)；
　　2.組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，可以促進(jìn)再生和髓鞘形成等相關(guān)因子的表達(dá)。
　　第三部分:周圍神經(jīng)損傷后近端神經(jīng)的基因表達(dá)和核心調(diào)控因子分析
　　目的
　　采用基因芯片技術(shù)檢測坐骨神經(jīng)損傷后差異基因的表達(dá)，通過 Signal-flow方法，尋找周圍神經(jīng)損傷后近端神經(jīng)損傷應(yīng)答相關(guān)的核心調(diào)控因子，為優(yōu)化組織工程化神經(jīng)提供理論依據(jù)。
　　方法
　

11、　1.采用隨機(jī)方差模型（RVM），系統(tǒng)性分析大鼠坐骨神經(jīng)橫斷后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h近端神經(jīng)表達(dá)譜芯片，分析顯著性差異表達(dá)基因；
　　2.對差異基因進(jìn)行表達(dá)趨勢 STC的顯著性分析，得到顯著性的表達(dá)趨勢和趨勢的所屬基因；
　　3.對主流表達(dá)趨勢所包含的基因進(jìn)行功能顯著性分析和Pathway分類，得出主流趨勢的基因最顯著、靶向的功能和參與的顯著性的Pathway；
　　4.根據(jù)差異基因參與的顯著性Path

12、way，利用數(shù)據(jù)庫中的基因間的調(diào)控關(guān)系與基因的表達(dá)情況，定量化研究不同時間序列下的基因間的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Signal-Flow。從而發(fā)現(xiàn)對整個基因表達(dá)變化影響最顯著的核心調(diào)控因子；
　　5.結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　(1) qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果；
　　(2) Western blot/免疫熒光檢測不同時間點(diǎn)重要候選因子的表達(dá)和定位；
　　(3)原代培養(yǎng)施萬細(xì)胞，采用基因干預(yù)、western blot等方法進(jìn)行相關(guān)功能

13、的驗(yàn)證；
　　(4)關(guān)鍵核心調(diào)控因子的信號通路研究。
　　結(jié)果
　　1.大鼠坐骨神經(jīng)離斷后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h后，采用隨機(jī)方差模型(RVM)進(jìn)行差異基因(mRNA)的篩選，共有2850個顯著性差異表達(dá)基因(P<0.01)；
　　2.基于 KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用 Fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)（P value<0.001），共得到9個 Pathway參與坐骨神經(jīng)損傷早期反應(yīng)，分別與細(xì)胞因子

14、的相互作用、細(xì)胞黏附、TLRs信號途徑、細(xì)胞凋亡等相關(guān)；
　　3. Signal-Flow分析表明，抗凋亡因子、緊密連接因子、細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附分子等，構(gòu)成整個信號傳遞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心成分，與炎癥因子TNF-α信號通路相關(guān)的抗凋亡分子Birc2, Birc3和Tnfrsfla等在整個網(wǎng)絡(luò)中顯示較大的權(quán)重；
　　4. ELISA檢測坐骨神經(jīng)損傷后，TNF-α炎癥因子在0h,0.5h,1h,3h,6h,9h和12h表達(dá)升高；Bir

15、c2, Birc3和Tnfrsfla的表達(dá)也相應(yīng)升高；
　　5.免疫組化結(jié)果顯示，Birc2, Birc3和Tnfrsfla與坐骨神經(jīng)S100陽性細(xì)胞共定位，表明施萬細(xì)胞Birc2, Birc3和Tnfrsfla參與炎癥因子介導(dǎo)的抗凋亡；
　　6.濃度為40ng/ml的 TNF-α處理原代培養(yǎng)的施萬細(xì)胞12h或者濃度為10 ng/ml或20 ng/ml TNF-α作用24h，均能顯著上調(diào)凋亡因子cleaved-caspase

16、3的表達(dá)；
　　7. Birc2、Birc3或Tnfrsfla SiRNA干擾施萬細(xì)胞，48h和72h后，流式細(xì)胞和TUNEL結(jié)果表明，施萬細(xì)胞的凋亡發(fā)生明顯增加。48 h時，對照組凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的的11.18%，Birc2-siRNA凋亡細(xì)胞數(shù)為25.87%(P<0.05)，Birc3-siRNA凋亡細(xì)胞數(shù)為28.94%(P<0.05)，Tnfrsf1a-siRNA組為28.64%(P<0.01)；而在72 h時，對照組凋

17、亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的的16.91%，Birc2-siRNA凋亡細(xì)胞數(shù)為32.23%(P<0.01)，Birc3-siRNA凋亡細(xì)胞數(shù)為36.01%(P<0.01)，Tnfrsf1a-siRNA組則達(dá)到37.52%(P<0.01)；
　　8.干擾了Birc2, Birc3和Tnfrsfla的48h和72h后，凋亡相關(guān)因子cleaved-caspase3和caspase6的表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；
　　9. EdU染色檢

18、測不同濃度(0,2,5,10,20,40ng/ml)的TNF-α對原代培養(yǎng)施萬細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，低濃度的TNF-α（≤2 ng/ml）能促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖(P<0.05)；而高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）則明顯抑制增殖(P<0.01)；TNF-α抑制劑能明顯降低TNF-α的濃度效應(yīng)；
　　10. Transwell結(jié)果表明，高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）能明顯抑制原代培養(yǎng)施萬細(xì)胞的遷移；
　　11.

19、形態(tài)學(xué)和生化檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）能誘發(fā)施萬細(xì)胞的凋亡。透射電鏡顯示，用10、20或40 ng/ml TNF-α處理后的施萬細(xì)胞明顯發(fā)生核固縮、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、以及凋亡小體的形成等典型的凋亡形態(tài)學(xué)的改變；施萬細(xì)胞caspase-7, caspase-8和caspase-9表達(dá)與陰性對照組相比，顯著增加；AnnexinⅤ染色結(jié)果顯示，TNF-α抑制劑能降低濃度為40 ng/ml TNF-α處理后施萬細(xì)胞的凋亡，

20、且呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系(P<0.01)；
　　12. Co-IP結(jié)果顯示 FADD或 RIP都可以與 TRADD結(jié)合形成蛋白復(fù)合物， FADD與TRADD的相互作用隨著TNF-α濃度的升高而增強(qiáng)(P<0.01)；與此相反， RIP與TRADD的相互作用隨著TNF-α濃度的升高而降低(P<0.01)；
　　13. Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p-JNK的表達(dá)量隨著TNF-α處理濃度的升高而持續(xù)增加(P<0.01)；而p-NF

21、-κB p65的表達(dá)量隨著TNF-α濃度的升高顯著降低(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　1.周圍神經(jīng)損傷后，近端神經(jīng)在短時間內(nèi)對炎癥反應(yīng)作出應(yīng)答，上調(diào)核心調(diào)控因子Birc2, Birc3和Tnfrsfla的表達(dá)，參與調(diào)控炎癥因子TNF-α誘發(fā)的抗凋亡；施萬細(xì)胞是關(guān)鍵的靶細(xì)胞；
　　2.低濃度（≤2 ng/ml）的炎癥因子TNF-α能促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖和遷移；而高濃度（≥10 ng/ml）的TNF-α則誘發(fā)施萬細(xì)胞的凋亡；