組織工程化周圍神經(jīng)修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、第一章大鼠去細胞組織工程化神經(jīng)支架的制備及形態(tài)學研究 目的：采取化學處理方法，去除大鼠周圍神經(jīng)中的細胞和髓鞘以取得去細胞的組織工程化神經(jīng)支架。 方法：10只SD大鼠，共20條坐骨神經(jīng)分為2組，每組10條。分別為正常神經(jīng)對照組和化學去細胞實驗組。然后在光鏡和電鏡下對各組神經(jīng)組織行組織學結構觀察，通過免疫組織化學分析其成分。 結果：去細胞神經(jīng)呈淡乳白色圓柱狀外觀，略透亮，其延展性較化學處理前略增加。經(jīng)脫細胞處理后，去

2、除了Schwann細胞、神經(jīng)纖維的髓鞘和軸突，保存了由Schwann細胞基底膜管以及神經(jīng)外膜和束膜的細胞外基質(zhì)構成的三維支架結構。 結論：化學處理所獲得的去細胞神經(jīng)在組織結構和成分上已經(jīng)達到了相應的要求，能否成為有效的神經(jīng)移植修復材料，仍需要進一步的實驗研究加以驗證。 第二章大鼠脂肪干細胞的培養(yǎng)及向類Schwann細胞的誘導分化 目的：掌握大鼠脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其生物學特性及向類Schwa

3、nn細胞方向分化的條件。 方法：無菌技術下切取近交系大鼠雙側腹股溝脂肪墊，加入適量Ⅰ型膠原酶消化獲取脂肪干細胞，接種入含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)變化。取傳代細胞用流式細胞儀檢測表面抗原標志CD<,29>、CD<,34>、CD<,44>；四唑鹽比色試驗(MTT法)測定第1、4、10代細胞的生長曲線；原代細胞傳代至第4代，進行誘導培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察脂肪干細胞生長情況、誘導前后的形態(tài)學變化，

4、S-100、GFAP免疫細胞化學染色并計算其陽性率和染色灰度值。 結果：原代培養(yǎng)顯示原代細胞3天左右開始貼壁，呈梭形成纖維樣細胞形態(tài)，8d左右可達90％融合，呈旋渦狀排列，形成集落。傳代后2～4h開始貼壁，經(jīng)過較短的潛伏期后開始增殖，3d即可長滿。10代以后細胞傳代后潛伏期延長，細胞增殖速度逐漸減慢。流式細胞儀檢測結果有95％的細胞表達CD<,44>，96％的細胞表達CD<,29>，而只有5％的細胞表達CD<,34>。生長曲線顯

5、示第1、4代大鼠脂肪干細胞增殖能力較強，以第4代細胞為甚，第10代細胞增殖能力減弱。依次加入誘導劑后部分細胞向Schwann細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，免疫細胞化學染色S-100、GFAP呈陽性表達。誘導至第4d時細胞染色陽性率及灰度值優(yōu)于誘導2d,8d組。 結論：1．從大鼠脂肪組織中可以有效地分離、培養(yǎng)具有間充質(zhì)干細胞的特性的脂肪干細胞。2．脂肪干細胞可以在體外經(jīng)誘導分化為類Schwann細胞。 第三章經(jīng)誘導分化的大鼠脂肪干細胞用于

6、構建組織工程化周圍神經(jīng)的實驗研究 目的：應用去細胞神經(jīng)支架及誘導分化的脂肪干細胞構成組織工程化周圍神經(jīng)，了解兩者相容性，以及組織工程化周圍神經(jīng)修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗效果，為臨床研究提供資料。 方法：按照前述方法培養(yǎng)并誘導近交系大鼠脂肪干細胞向類Schwann分化，將誘導分化的脂肪干細胞懸液注入己制備的去細胞同種異體神經(jīng)支架管中，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況；掃描電鏡下觀察細胞在材料上附著情況；四唑鹽比色試驗(MTT法)

7、測定細胞活性；取兩組近交系大鼠，分別用組織工程化神經(jīng)和自體神經(jīng)橋接10mm神經(jīng)缺損，通過大體觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)恢復率(SFI％)的測定、神經(jīng)電生理(NEP)的測定、組織學光鏡觀察、透射電鏡觀察、再生有髓神經(jīng)纖維計數(shù)恢復率、神經(jīng)纖維直徑恢復率、髓鞘厚度恢復率的測定等指標評價實驗效果。 結果：1w后掃描電鏡下可見接種的類Schwann細胞分散在材料表面的孔隙內(nèi)，細胞形態(tài)為星狀，細胞突起與支架管壁粘附；MTT法測定細胞活性示神經(jīng)支

8、架組在各時間點與對照組無顯著性差異(P>0.05)；12w時兩組動物坐骨神經(jīng)外觀、組織學光鏡觀察、透射電鏡觀察結果相似、兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)恢復率(SFI％)、神經(jīng)電生理(NEP)、再生有髓神經(jīng)纖維計數(shù)恢復率、神經(jīng)纖維直徑恢復率、髓鞘厚度恢復率等指標相比無顯著性差異(P>0.05)。 結論：1．去細胞同種異體神經(jīng)與類Schwann細胞的組織相容性好，未見明顯排異反應。2．兩者構建的組織工程化神經(jīng)能有效地修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損，其效