川芎嗪對組織工程神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損作用的實驗研究.pdf

1、第一部分川芎嗪對基因修飾或缺血缺氧損傷鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞的保護作用
　　目的:構(gòu)建SD乳鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外缺血缺氧損傷及基因修飾模型;探討TMP對神經(jīng)干細(xì)胞基因修飾與缺血缺氧損傷的保護作用，以及TMP促進神經(jīng)損傷修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制，為TMP作為神經(jīng)干細(xì)胞保護劑提供細(xì)胞生物學(xué)理論依據(jù)。
　　方法:(1)分離SD乳鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)進行原代培養(yǎng)，將二代NSCs行神經(jīng)巢蛋白(Nestin)及誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)絲蛋白

2、(NF-200)與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光鑒定。取二代神經(jīng)干細(xì)胞行攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染并更換完全培養(yǎng)基，然后按TMP實驗組、基因修飾對照組(GM control)、溶媒對照組(Vehicle control)分組，同時設(shè)正常對照組(Normal control)。其中TMP實驗組在DMEM/F12培養(yǎng)基中分別加入工作濃度為50、100、200和300μ g/ml的TMP，溶媒對照組在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入0

3、.1％DMSO作為溶劑對照，正常對照組為未行基因修飾的二代神經(jīng)干細(xì)胞。各組均在常規(guī)條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。通過MTT比色法、錐蟲藍染色計數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞活力和損傷凋亡情況，Quantitative real-time PCR和Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達。
　　另取二代NSCs分為TMP實驗組(TMP group)、缺血缺氧對照組(OGDcontrol

4、)、溶媒對照組(Vehicle control)和正常對照組(Normalcontrol)分別培養(yǎng)6h。其中缺血缺氧對照組、溶媒對照組和TMP實驗組均采用OGD(oxygen-glucose-deprivation)法構(gòu)建體外缺血缺氧損傷模型，溶媒對照組在缺血缺氧造模前即給予0.1％DMSO作為溶劑對照，TMP實驗組則在造模前即刻分別加入工作濃度為50、100、200和300μg/ml的TMP，直至造模結(jié)束。正常對照組則不作任何處理在常

5、規(guī)條件下培養(yǎng)6h。通過MTT比色法、錐蟲藍染色計數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞活力和損傷凋亡情況，Quantitative real-time PCR和Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達。
　　結(jié)果:(1)與正常對照組比較，溶媒對照組和基因修飾對照組NSCs活力均顯著降低，細(xì)胞死亡率及細(xì)胞凋亡率均顯著增高(均P＜0.05)，而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表達下調(diào)，

6、促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達上調(diào)（均P＜0.05）;但基因修飾對照組與溶媒對照組組間比較上述指標(biāo)無明顯差異（均P＞0.05）;與基因修飾對照組比較，TMP實驗組呈一定濃度依賴性，能濃度依賴地減少細(xì)胞死亡率及凋亡率，增強細(xì)胞增殖活性，且TMP可顯著上調(diào)基因修飾后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表達水平，下調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平，但基因修飾對照組和50、100μ g/mlTMP組間無

7、明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，200μg/mlTMP組與300μ g/mlTMP組間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05)。(2)與正常對照組比較，溶媒對照組和缺血缺氧對照組NSCs活力均顯著降低，細(xì)胞死亡率及細(xì)胞凋亡率均顯著增高(均P＜0.05)，而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表達下調(diào)，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達上調(diào)（均P＜0.05）;但缺血缺氧對照組與溶媒對照組組間比較上述指標(biāo)無明顯差異（均P＞0.

8、05）;與缺血缺氧對照組比較，TMP實驗組呈一定濃度依賴性，能濃度依賴地減少細(xì)胞死亡率及凋亡率，增強細(xì)胞增殖活性，且TMP可顯著上調(diào)基因修飾后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表達水平，下調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平，但缺血缺氧對照組和50、100μ g/mlTMP組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，200μg/mlTMP組與300μg/mlTMP組間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:TMP

9、能夠濃度依賴性地對基因修飾后或缺血缺氧損傷的NSCs發(fā)揮保護作用，且該作用與其調(diào)控凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，這可能是TMP對周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護作用的相關(guān)機制之一。
　　第二部分含川芎嗪培養(yǎng)液對組織工程化神經(jīng)橋接物生物學(xué)特性的影響
　　目的:化學(xué)法萃取Wistar大鼠脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)，構(gòu)建種植基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的組織工程化神經(jīng)橋接物，探討含TMP培養(yǎng)基對橋接物生物學(xué)特性的影響，

10、為移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損提供理想的橋接體。
　　方法:(1)12只成年健康Wistar雄性大鼠，切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)（共24條），每條長約2 cm，其中20條按下列順序進行化學(xué)處理:①剝除外覆結(jié)締組織，無菌蒸餾水清洗3次。②放入3％ TritonX-100中震蕩24h后無菌蒸餾水清洗3次。③放入4％脫氧膽酸鈉中室溫下震蕩24h后無菌蒸餾水清洗3次。④重復(fù)2～3步驟，直至形成的去細(xì)胞神經(jīng)呈乳白色、半透明樣。HE染色、透射電鏡掃描觀察化學(xué)去

11、細(xì)胞神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)。⑤將化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)放入DMEM/F12液中4℃保存?zhèn)溆谩?2)取12條去細(xì)胞神經(jīng)水化后在顯微鏡下用微量加樣器注入10uI基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞懸液(2×106/ml)后分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組，Ⅰ、Ⅱ組各5條，Ⅲ組2條，其中Ⅰ、Ⅱ組分別在常規(guī)DMEM/F12完全培養(yǎng)基和添加有200μg/mlTMP的完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1周;?、?、Ⅱ、Ⅲ三組各2條切片行熒光顯微鏡、HE染色與免疫組化(Nestin、NF-200、GFAP)染色觀察細(xì)

12、胞分布與支架結(jié)構(gòu)。(3)另取SD大鼠24只分A、B、C、D4組，每組6只，分別將4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神經(jīng)、Ⅰ組組織工程化神經(jīng)、Ⅱ組組織工程化神經(jīng)及同種異體SD大鼠坐骨神經(jīng)依次包埋于皮下，7天后取出各組移植神經(jīng)行HE染色光鏡觀察及CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞侵潤數(shù)量檢測。另取SD大鼠24只分A、B、C、D4組，每組6只，分別將4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神經(jīng)、Ⅰ組組織工程化神經(jīng)、Ⅱ組組織工程化神經(jīng)及同種異體SD大鼠坐骨神經(jīng)依

13、次包埋于皮下，7天后取出各組移植神經(jīng)行HE染色光鏡觀察及CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞侵潤數(shù)量檢測。
　　結(jié)果:去細(xì)胞神經(jīng)的橫切片上可見神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜形成的圓形結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部為松散的膠原成分髓鞘及細(xì)胞成分基本消失。神經(jīng)外膜和細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)均較完整?？v切片上可見較多整，齊排列的管道樣結(jié)構(gòu)，基本無細(xì)胞成分。注射神經(jīng)干細(xì)胞后縱切片上可見神經(jīng)外膜下和束膜間有較多細(xì)胞成份，分布不均。培養(yǎng)1周后兩組均有較多增殖與分化神經(jīng)細(xì)胞，基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞

14、在去細(xì)胞橋神經(jīng)中生長良好，并且有遷移成行的特性，但Ⅱ組更明顯，與Ⅰ組差異有顯著性(P＜0.05)。皮下包埋后光鏡下見藍色淋巴細(xì)胞浸潤依次減少，A、B、C組間均有顯著差異。C、D組間無顯著差異。神經(jīng)內(nèi)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞侵潤數(shù)A組最多，D組最少，A、B、C組間均有顯著差異。C、D組間無顯著差異。
　　結(jié)論:異體神經(jīng)化學(xué)萃取法可去除神經(jīng)中的細(xì)胞和髓鞘而保留完整的神經(jīng)基底膜管和纖維支架結(jié)構(gòu)，并且對神經(jīng)基底膜主要成分-層粘連蛋白無明

15、顯影響。種植神經(jīng)干細(xì)胞并在含TMP培養(yǎng)基中培養(yǎng)后制作的組織工程化神經(jīng)具有較低免疫原性及正常神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)，可能成為一種理想的組織工程化人工神經(jīng)，作為修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的橋接物。
　　第三部分川芎嗪預(yù)處理組織工程化神經(jīng)橋接物修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究
　　目的:研究川芎嗪預(yù)處理對組織工程化神經(jīng)橋接物修復(fù)大鼠1.5cm坐骨神經(jīng)缺損的效果。
　　方法:分別按前述方法制作基因修飾的SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞、脫細(xì)胞的Wistar大鼠

16、坐骨神經(jīng)、種植神經(jīng)干細(xì)胞并在含川芎嗪培養(yǎng)基中共培養(yǎng)1周的組織工程化神經(jīng)。將55只200-250克成年雌性SD大鼠分為A、B、C、D共4組，A、B、C組各15只，D組10只，實驗側(cè)均為右后肢坐骨神經(jīng)。1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，顯露坐骨神經(jīng)，從梨狀肌下緣0.5cm處切除神經(jīng)1.5cm，分別用4種移植物橋接大鼠1.5cm坐骨神經(jīng)缺損:含川芎嗪的組織工程化神經(jīng)組（A組）、脫細(xì)胞異體神經(jīng)組（B組）、異體神經(jīng)組（C組）、自體神經(jīng)組（D組）。術(shù)后

17、A組術(shù)側(cè)小腿三頭肌內(nèi)注射TMP液（16mg/kg/日），其余各組（B、C、D組）注射相同體積0.9％NS，連續(xù)注射12周至實驗結(jié)束。術(shù)后2周、12周通過大體觀察、神經(jīng)電生理檢測、肌肉濕重稱重、熒光顯微鏡觀察、辣根過氧化物酶(HRP)逆行示蹤及組織學(xué)指標(biāo)評價各組修復(fù)神經(jīng)缺損的效果。
　　結(jié)果:術(shù)后12周大體觀察發(fā)現(xiàn)A、D組實驗側(cè)足趾明顯散開，足趾印跡分散，恢復(fù)足爪著地行走，右后肢蹬力良好，明顯優(yōu)于B、C組;A組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定、

18、運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉濕重恢復(fù)均優(yōu)于B、C組(P＜0.05)，略差于D組(P＞0.05);熒光顯微鏡與免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)，NSCs能在體內(nèi)存活、遷移并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，A組優(yōu)于B、C組;術(shù)后12周辣根過氧化物酶(HRP)逆行示蹤檢測提示A組脊神經(jīng)節(jié)中HRP標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)較B、C組多(P＜0.05)，甲苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)A組移植段再生神經(jīng)纖維較多，以有髓神經(jīng)纖維為主，明顯優(yōu)于B、C組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:種植神經(jīng)干細(xì)胞并在