神經(jīng)干細胞移植修復周圍神經(jīng)缺損的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的探討神經(jīng)干細胞(neuralstemce¨s,NSCs)移植修復周圍神經(jīng)缺損的可行性,為建立促進周圍神經(jīng)再生新方法提供實驗依據(jù)。 方法①建立NSCs體外培養(yǎng)模型:分別取胚胎(E12)和新生(出生1d)SD大鼠的大腦皮層分離培養(yǎng),通過形態(tài)學觀察和Nestin免疫細胞化學鑒定,以及BrdU(5.溴脫氧尿核苷)法檢測細胞增殖能力,并對其分化后的細胞檢測成熟神經(jīng)細胞標志抗原MAP2和GFAP。②建立雪旺細胞(Schwanncel1s

2、,SCs)體外培養(yǎng)模型:分別取新生和成年SD大鼠的坐骨神經(jīng),用混合酶消化法、差速貼壁法和低濃度胰酶快速消化法進行培養(yǎng)和純化,通過形態(tài)學觀察和S㈣免疫細胞化學鑒定,并行MTT法檢測細胞增殖能力。③研究NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿的生物相容性:從胚胎鼠大腦皮層獲得的NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿在有血清和無血清的不同條件下聯(lián)合培養(yǎng),觀察NSCs生長情況及形態(tài)變化,并對其進行免疫細胞化學染色。④NSCs移植修復周圍神經(jīng)缺損:45只SD大鼠,將其

3、坐骨神經(jīng)切除后造成12mm神經(jīng)缺損模型,用幾丁質(zhì)膜和明膠海綿橋接,隨機分成3組,每組15只。在幾丁質(zhì)膜管中分別植入:A:胚胎鼠BrdU—NSCs;B:新生鼠BrdU—SCs;C:生理鹽水,為空白對照組。術(shù)后4w、8w、12w,各組分別通過大體觀察、神經(jīng)電生理、組織學檢查再生神經(jīng)組織,并對NSCs、SCs移植后的存活情況進行檢測。 結(jié)果①胚胎和新生大鼠NSCs培養(yǎng)、分化特點:取自胚胎和新生大鼠大腦皮層的細胞均呈現(xiàn)NSCs克隆球形態(tài)

4、,表達NSCs特異性標志蛋白Nestin,并具有自我更新及體外擴增傳代能力,可以誘導分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,但兩組細胞的Nestin及BrdU陽性率均有顯著性差異(P<0.05)。②新生和成年大鼠SCs培養(yǎng)、純化特點:新生和成年大鼠SCs生長狀態(tài)良好,均呈S100免疫細胞化學反應陽性,純度均達95%以上,由生長曲線顯示新生鼠SCs生長更快,第2代SCs倍增時間:新生鼠3d、成年鼠4d。③NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿的生物相容性:NS

5、Cs接種至幾丁質(zhì)膜和明膠海綿后,在NSCs選擇培養(yǎng)基中NSCs球往往粘附在幾丁質(zhì)膜上,仍能保持球形生長的特性,呈Nestin免疫細胞化學反應陽性;在NSCs分化培養(yǎng)基中可見到大量的細胞從神經(jīng)球周邊遷出,分化成各種神經(jīng)細胞,形態(tài)學觀察和免疫熒光染色結(jié)果提示大部分細胞為MAP2陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星型膠質(zhì)細胞,極少數(shù)S100陽性的SCs樣細胞,少突膠質(zhì)細胞難以檢測到。④NSCs移植術(shù)后存活情況的檢測及再生神經(jīng)組織的檢查:術(shù)后8w再生

6、神經(jīng)免疫組化檢測仍觀察到有存活的NSCs、SCs,且NSCs存活數(shù)量多于SCs,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);術(shù)后各時間點,大體觀察、坐骨神經(jīng)一肌肉復合動作電位的波幅(AMP)和神經(jīng)傳導速度(NCV)、再生軸突的數(shù)目和直徑、髓鞘的厚度比較,A組均優(yōu)于B、C組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論①胚胎鼠NSCs數(shù)量多且增殖能力強,新生鼠SCs生長快且增殖能力強,二者更適合作為神經(jīng)組織工程的種子細胞。②幾丁質(zhì)膜、明膠海綿對

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