神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：神經(jīng)干細(xì)胞的研究近幾年來(lái)是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，其體外的分離、純化、培養(yǎng)已經(jīng)日趨成熟，其替代治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病正逐步走向臨床應(yīng)用當(dāng)中，但就其具體的移植途徑、移植時(shí)間窗等問(wèn)題尚沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)范，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠腦缺血MCAO模型進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療，對(duì)腦卒中患者針對(duì)細(xì)胞替代治療的移植時(shí)間上、移植途徑等問(wèn)題上做進(jìn)一步探討，并印證細(xì)胞替代治療的安全性及可靠性。 方法：取8-12周胎兒，取其腦組織體外分離、純化，采用EGF、bFGF及

2、B27聯(lián)合培養(yǎng)，原代培養(yǎng)經(jīng)誘導(dǎo)、分化后，進(jìn)行免疫熒光染色，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；選取280～320gSD大鼠，應(yīng)用0.2em尼龍線，采用線栓法制作MCAO大鼠模型，制作成功3周后，取鼠腦，明確梗死灶存在并進(jìn)行HE染色；神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)約20～25天后取生長(zhǎng)活力良好的克隆球，于MCAO模型制作成功后第三周，對(duì)缺血半暗帶進(jìn)行多點(diǎn)注射進(jìn)行細(xì)胞移植，每個(gè)位點(diǎn)注射5ul，移植前2天做BrdU標(biāo)記，于移植后1周和4周分別做BrdU陽(yáng)性檢測(cè)。4周后

3、進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)、神經(jīng)功能評(píng)判并取鼠腦進(jìn)行免疫組化分析。 結(jié)果：從8-12周胎兒腦組織中成功分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用EGF、bFGF以及B27能夠在體外穩(wěn)定的培養(yǎng)、擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)Nestin染色陽(yáng)性，分化10天后分別經(jīng)NSE、GFAP、CNP染色呈陽(yáng)性結(jié)果，證明培養(yǎng)細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞；大鼠MCAO模型制作成功3周后，腦大體標(biāo)本見(jiàn)明顯軟化灶形成、位置恒定，HE染色發(fā)現(xiàn)明顯梗死灶：細(xì)胞移植四周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分未

4、見(jiàn)明顯差異，可能與動(dòng)物模型制作有關(guān)；行為學(xué)上，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的對(duì)側(cè)前肢存在明顯差異，實(shí)驗(yàn)組有明顯的改善。移植后1周和4周，在移植位點(diǎn)均檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，1周時(shí)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞局限在注射位點(diǎn)，4周時(shí)見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)向周邊遷移，觀察到的最遠(yuǎn)遷移距離為0.8mm。免疫組化發(fā)現(xiàn)移植的干細(xì)胞存在分化，大部分是膠質(zhì)細(xì)胞，存在NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元性細(xì)胞。 結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用EGF、bFGF和B27可以從8～12個(gè)月胎兒腦組織中分離培養(yǎng)出