OEC-SC-ECM-PLGA橋接體對大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)作用.pdf

1、周圍神經(jīng)缺損性損傷在臨床上極為常見，雖然精細(xì)的神經(jīng)顯微外科技術(shù)已用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，但修復(fù)后神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不令人滿意。自體神經(jīng)移植被認(rèn)為是修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的最基本和最有效的方法，然而自體神經(jīng)移植需要犧牲正常神經(jīng)，產(chǎn)生供區(qū)合并癥，同時供體神經(jīng)來源有限，對長段、嚴(yán)重、多處的周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)效果差，因此應(yīng)用組織工程學(xué)原理和技術(shù)方法研制的人工神經(jīng)就成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。嗅球成鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，O

2、EC)是一種特殊類型的膠質(zhì)細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)作用。雪旺氏細(xì)胞(Schwann cells，SC)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的成髓鞘細(xì)胞，在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮多種重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)成份(extracellular matrix，ECM)對神經(jīng)再生具有明顯的引導(dǎo)和促進(jìn)作用。聚乳酸，聚羥基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co-glycolide)，PLGA)是已被美國食品和藥物管理局(U.S Food and Drug Admini

3、stration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床的人工神經(jīng)支架材料。基于上述背景，本實(shí)驗(yàn)采用用四者構(gòu)成OEC-SC-ECM-PLGA橋接體，切除大鼠15mm坐骨神經(jīng)后，觀察其對坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)效果。據(jù)作者所知，本實(shí)驗(yàn)首次同時應(yīng)用OEC和SC組建人工神經(jīng)，因而對臨床周圍神經(jīng)缺損修復(fù)具有參考價值，并豐富周圍神經(jīng)缺損修復(fù)理論。 本實(shí)驗(yàn)采用新生3d SD大鼠為供體，迅速分離嗅球的嗅神經(jīng)層和嗅顆粒層，采用酶消化法分離細(xì)胞，差速貼壁法純化細(xì)胞，接種

4、于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)2d，NGFRp75和S100蛋白雙標(biāo)免疫組化、Hoechst33342復(fù)染鑒定OEC的純度。SC也來自相同供體，方法為迅速分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)后，以酶消化法和差速貼壁法分離、純化細(xì)胞，接種于層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)2d，采用S100蛋白免疫組化和Hoechst33342復(fù)染鑒定其純度。建立15mm的SD大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)缺損模型后，用CM-DiI標(biāo)記的OEC和Hoechst33342標(biāo)記的SC、細(xì)胞外基質(zhì)凝

5、膠以及自行制備的PLGA支架，構(gòu)建OEC-SC-ECM-PLGA橋接體進(jìn)行修復(fù)，同時設(shè)OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM-PLGA組、PLGA組、自體神經(jīng)移植組為對照組，在術(shù)后9w時間內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞示蹤、運(yùn)動終板染色、神經(jīng)纖維逆行示蹤、脊髓神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)再生速度、神經(jīng)電生理、形態(tài)計量等檢測，以從結(jié)構(gòu)和功能兩個角度，外周和中樞兩個層面，全面評價所建橋接體對坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)作用。 所取得的主要結(jié)果如下：

6、 1.倒置顯微鏡下，OEC輪廓清晰，胞體扁平，立體感強(qiáng)，呈雙極或多極，突起細(xì)長，出現(xiàn)細(xì)胞間聯(lián)系。NGFRp75和S-100免疫熒光鑒定的OEC純度為95％左右。 2.倒置顯微鏡下，SC胞體飽滿，呈長梭形，兩端突起較長，呈極性生長趨勢，細(xì)胞間聯(lián)系不十分明顯。S-100免疫熒光鑒定的SC純度為95010左右。 3.自行構(gòu)建的PLGA神經(jīng)支架在干燥狀態(tài)下呈白色泡沫狀結(jié)構(gòu)，表面不平，可見白色細(xì)小顆粒。PLGA支架孔隙率為85

7、％左右，掃描電鏡下PLGA支架呈多孔樣，孔徑大小不一，腔壁光滑。 4.術(shù)后9w時，OEC-SC-ECM-PLGA組的腳趾自噬率低于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM-PLGA組、PLGA組，與自體神經(jīng)移植組相當(dāng)。 5.CM-Dil標(biāo)記的OEC和Hoechst33342標(biāo)記SC可在橋接體內(nèi)至少存活6周。SC的存活率高于OEC。兩者沿神經(jīng)縱軸呈梭形分布，并向橋接體近心端和遠(yuǎn)心端坐骨神經(jīng)內(nèi)遷移至少2.

8、5mm。 6.術(shù)后3w，OEC-SC-ECM-PLGA組的脊髓前角凋亡細(xì)胞數(shù)為6.8±1.6，顯著低于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM-PLGA組和PLGA組(P<0.01)，但顯著高于自體神經(jīng)移植組(P<0.01)。 7.術(shù)后9w內(nèi)，OEC-SC-ECM-PLGA組感覺功能持續(xù)改善，回縮時間顯著優(yōu)于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM-PLGA組、PLGA組(P<0.

9、05)，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)，但未恢復(fù)至正常水平(P<0.05)，其坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciaticfunction index，SFI)也顯著好于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM- PLGA組和PLGA組(P<0.05)，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)未恢復(fù)至正常(P<0.01)。 8.自術(shù)后第6w至第9w，OEC-SC-ECM-PLGA組和自體神經(jīng)移植組的

10、神經(jīng)再生速度均為0.71±0.00 mm/d，顯著快于OEC-ECM-PLGA組和SC-ECM-PLGA組的神經(jīng)再生速度(P<0.05)。 9.術(shù)后9w時，OEC-SC-ECM-PLGA組的腓腸肌濕重，恢復(fù)至70.77±4.25％，顯著高于OEC-ECM-PLGA組、ECM- PLGA組和PLGA組(P<0.05)，與SC-ECM-PLGA組和自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)，但未恢復(fù)至正常水平；同時其運(yùn)動終板數(shù)量已恢復(fù)

11、至16.4±1.1個，顯著高于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組、ECM-PLGA組和PLGA組的運(yùn)動終板數(shù)量(P<0.01)，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)，尚未恢復(fù)到正常水平(P<0.01)。 10.術(shù)后9w時，OEC-SC-ECM-PLGA組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度和復(fù)合肌肉動作電位的波幅為分別為17.77±1.40 m/s和3.75±0.37mV，顯著高于OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PL

12、GA組、ECM-PLGA組和PLGA組(P<0.01)，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)。 11.術(shù)后9w時，除ECM-PLGA組和PLGA組外其余各組均可見CM-Dil和CB-HRP逆行標(biāo)記的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元，OEC-SC-ECM-PLGA組標(biāo)記的神經(jīng)元的數(shù)量，顯著高于OEC-ECM-PLGA組和SC-ECM-PLGA組(P<0.05)，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異(P>0.05)。此外，SC-ECM-PLGA組也顯

13、著高于OEC-ECM-PLGA組(P<0.01)。 12.術(shù)后9w時，NF200/MBP雙標(biāo)免疫組化結(jié)果顯示，OEC-SC-ECM-PLGA組、OEC-ECM-PLGA組、SC-ECM-PLGA組和自體神經(jīng)移植組的再生神經(jīng)纖維均有髓鞘包繞。 13.術(shù)后9w時，再生神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色計量結(jié)果顯示，無論是中段還是遠(yuǎn)段，OEC-SC-ECM-PLGA組的神經(jīng)纖維密度顯著高于OEC-ECM-PLGA組和SC-ECM-PLGA組(P

14、<0.05)，但遠(yuǎn)未達(dá)到自體神經(jīng)移植組的水平(P<0.01)。 14.術(shù)后9w時，透射電鏡測量顯示，無論是中段還是遠(yuǎn)段，OEC-SC-ECM～PLGA組的有髓神經(jīng)纖維平均直徑和髓鞘厚度顯著高于OEC-ECM-PLGA組和SC-ECM-PLGA組(P<0.01)，但遠(yuǎn)未達(dá)到自體神經(jīng)移植組的水平(P<0.01)。SC-ECM-PLGA組遠(yuǎn)段的有髓神經(jīng)纖維平均直徑和髓鞘厚度也顯著高于OEC-ECM-PLGA組(P<0.01)。

15、 以上結(jié)果表明： 1.OEC和SC可在橋接體內(nèi)至少存活6w。 2.OEC-SC-ECM-PLGA橋接體通過促進(jìn)神經(jīng)聯(lián)接，提高神經(jīng)再生速度，增加有髓神經(jīng)纖維密度、直徑和髓鞘厚度而促進(jìn)缺損坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)恢復(fù)。 3.OEC-SC-ECM-PLGA橋接體通過減少自噬現(xiàn)象、縮短后肢回縮時間、提高坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、促進(jìn)足踝部潰瘍愈合、提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動作電位幅度而促進(jìn)缺損坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)。 4.OEC-SC-ECM-

16、PLGA橋接體移植修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損后，對外周靶組織的恢復(fù)具有促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)腓腸肌濕重的恢復(fù)和提高運(yùn)動終板的數(shù)目及其長軸和短軸的幅度；對脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元具有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為減少神經(jīng)元凋亡，增加神經(jīng)元數(shù)量。 5.OEC與SC兩種細(xì)胞合用修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的效果優(yōu)于單細(xì)胞移植。其中SC較OEC為優(yōu)，但其中任何一種細(xì)胞移植的修復(fù)效果都比無細(xì)胞移植好。 6.OEC-SC-ECM-PLGA橋接體可以促進(jìn)坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)