骨髓基質(zhì)干細胞復合膠原—殼聚糖神經(jīng)支架修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗性研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見和嚴重的創(chuàng)傷并發(fā)癥之一。目前，受損神經(jīng)的再生及功能修復仍是一項尚未解決的臨床難題。對于短節(jié)段的神經(jīng)缺損，可直接將其端-端吻合，使近端再生的神經(jīng)纖維能夠穿過受損區(qū)長入遠端。但長節(jié)段的神經(jīng)缺損，往往需要通過神經(jīng)移植術(shù)進行治療。自體神經(jīng)移植仍然是目前治療長節(jié)段神經(jīng)缺損的“金標準”。然而，自體神經(jīng)移植受到很多因素限制，如：供區(qū)神經(jīng)來源不足，需要手術(shù)獲取供體神經(jīng)，繼發(fā)供體神經(jīng)支配區(qū)肢體部分功能喪失以及供受神經(jīng)在組織結(jié)構(gòu)等方

2、面不匹配等。因此，尋找能夠替代自體神經(jīng)移植的方法是目前周圍神經(jīng)修復領(lǐng)域亟待解決的難題。
　　隨著組織工程研究逐漸成為研究的熱點，應(yīng)用組織工程學方法構(gòu)建組織工程神經(jīng)支架來橋接長節(jié)段神經(jīng)缺損收到比較滿意的效果。隨著研究的不斷深入，越來越多的具有高仿真結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架被報道，然而，僅有少數(shù)關(guān)于復合種子細胞神經(jīng)支架試驗研究的文獻報道。
　　本課題選用膠原為主要原料，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，構(gòu)建出在組成成分及內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面均與正常神經(jīng)高度相似

3、的具有軸向微管樣結(jié)構(gòu)的三維多孔支架材料。筆者又選用具有來源廣、易培養(yǎng)且具有多向分化能力等諸多優(yōu)點的骨髓基質(zhì)干細胞與其復合。利用多種形態(tài)學及功能學的研究方法綜合評估該復合支架橋接大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損的修復效果，并與自體神經(jīng)移植及單純支架移植比較，結(jié)果證實其療效接近自體神經(jīng)移植并優(yōu)于單純支架移植。具體內(nèi)容如下：
　　第一部分：骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的：探究大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法及生長條件，為其與膠原-殼聚糖

4、神經(jīng)支架復合并修復大鼠周圍神經(jīng)缺損奠定基礎(chǔ)。
　　方法：取體重約70g左右的SD大鼠，體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞。倒置相差顯微鏡下觀察原代、傳代及誘導分化細胞的生長情況及形態(tài)學改變，并描繪生長曲線。
　　結(jié)果：細胞貼壁生長并以細胞集落的方式增殖。培養(yǎng)至第3代的細胞呈分布均勻的紡錘形細胞生長?？赏ㄟ^簡單方法誘導其向神經(jīng)細胞及成骨細胞方向分化。
　　結(jié)論：培養(yǎng)至第3代的骨髓基質(zhì)干細胞具有較高的細胞純度，且具有良好的干細胞分化活

5、性，可作為組織工程種子細胞應(yīng)用。
　　第二部分：膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的構(gòu)建及其與骨髓基質(zhì)干細胞的復合
　　目的：構(gòu)建一種組織工程神經(jīng)支架，并觀察體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞在其內(nèi)部的生長情況，為種子細胞的移植提供階段性實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：以Ⅰ型膠原蛋白和殼聚糖為原料通過冷凍干燥技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)支架，掃描電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量其孔徑大小、孔隙率等指標。將體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞與Ⅰ型膠原蛋白-殼聚糖神經(jīng)支架復合，共培養(yǎng)3天；

6、掃描電鏡觀察細胞在支架內(nèi)部的生長情況。
　　結(jié)果：構(gòu)建出的神經(jīng)支架均為圓柱狀，內(nèi)部呈縱向平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，且孔徑均勻。細胞貼附在支架微管內(nèi)壁上，且生長狀況良好。
　　結(jié)論：Ⅰ型膠原蛋白-殼聚糖支架具有良好的內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)和生物相容性，可與細胞復合后用于修復周圍神經(jīng)缺損。
　　第三部分：復合神經(jīng)支架修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的有效性評估
　　目的：利用體內(nèi)試驗綜合評估復合神經(jīng)支架修復周圍神經(jīng)缺損的有效性。
　　方

7、法：應(yīng)用免疫組織學、透射電鏡觀察、神經(jīng)電生理檢測、逆行示蹤標記以及計算坐骨神經(jīng)指數(shù)等研究方法，從形態(tài)學和功能學兩方面綜合評估復合神經(jīng)支架修復大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損的效果。
　　結(jié)果：神經(jīng)支架在體內(nèi)能夠保持其完整結(jié)構(gòu)大約4周。復合支架材料組、單純支架材料組修復效果均接近自體神經(jīng)移植，復合支架材料組稍優(yōu)，有大量再生神經(jīng)纖維長入遠端。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，支架幾乎完全降解，并被大量再生神經(jīng)纖維替代（經(jīng)京尼平交聯(lián)后，本支架自發(fā)紅色熒光

8、）。修復段可見軸向微管間有NF160及S-100陽性的再生神經(jīng)纖維穿過，證實再生的神經(jīng)纖維通過了修復段。透射電鏡結(jié)果：新生的髓鞘比較纖細，結(jié)構(gòu)完整，有大量無髓神經(jīng)纖維和有髓神經(jīng)纖維共存，可觀察到板層結(jié)構(gòu)良好的髓鞘，再生神經(jīng)軸突情況良好，修復效果接近自體神經(jīng)移植。功能學檢測結(jié)果顯示：復合支架組的運動神經(jīng)傳導速度、潛伏期和波幅與自體神經(jīng)移植結(jié)果接近，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；熒光金標記后，觀察到陽性神經(jīng)元的數(shù)量在脊髓前角和背