人羊膜間充質干細胞來源的雪旺氏細胞樣細胞移植在皮瓣神經再生中的作用.pdf

1、目的：
　　通過體外對人羊膜間充質干細胞（human amniotic membrane mesenchymal stem cells，hAMSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定，并在體外誘導分化為雪旺氏細胞樣細胞（induce Schwann cells，iSCs），分別觀察兩種細胞移植對皮瓣神經再生的影響。
　　方法：
　　1）產婦知情同意后采集足月剖宮產羊膜，采用胰蛋白酶/膠原酶二步消化法分離提取hAMSCs，接種48h后

2、予以細胞換液以去除人羊膜上皮細胞，并按同樣方法傳1～2代，通過差速貼壁方法純化hAMSCs。流式細胞術和細胞免疫熒光鑒定hAMSCs。
　　2）取P3代生長至第6d的hAMSCs在體外誘導分化為iSCs，誘導分化后，分別取iSCs和P3代hAMSCs做免疫熒光染色檢測兩組細胞S-100、P75和GFAP的表達；Western blot檢測兩組細胞S-100、P75和GFAP蛋白的表達；實時熒光定量PCR檢測兩組細胞S-100、P7

3、5和GFAP基因表達；ELISA檢測hAMSCs培養(yǎng)6d以及hAMSCs誘導后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度。
　　3）建立大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型，分為三組：即hAMSCs移植組（A組）、iSCs移植組（B組）及穿支皮瓣模型對照組（C組），每組25只。取增殖期的P3代hAMSCs和誘導后的iSCs，分別于每只大鼠皮瓣標記處皮下多點注射1×106個相應細胞，C組注射PBS。免疫熒

4、光染色觀察神經再生，分別于細胞移植后2d、5d、7d、9d、14d各組取5只動物。
　　結果：
　　1）本實驗中采用胰蛋白酶/膠原酶雙酶化法可以獲得大量增殖穩(wěn)定的hAMSCs，并利用差速貼壁法可去除大量的人羊膜上皮細胞，獲得純度較高的hAMSCs。hAMSCs原代培養(yǎng)48h后可見細胞貼壁生長，5～6d細胞密度可達到80％～90%。流式細胞鑒定：CD90（99.61%）、CD44（99.64%）、CD73（99.82%）、CD

5、105（91.84%）呈陽性， CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性（0.12%）。細胞免疫熒光染色結果顯示hAMSCs高表達波形蛋白，未表達CK19。
　　2）免疫熒光染色結果顯示iSCs組S-100、P75和GFAP的表達量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；Western blot結果顯示iSCs組S-100、P75和GFAP蛋白表達量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；qPCR結果顯示iSC

6、s組S-100、P75和GFAP的基因表達量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；ELISA分別檢測hAMSCs培養(yǎng)6d以及hAMSCs誘導后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度：可見hAMSCs培養(yǎng)6天后BDNF和NGF均有表達，加入誘導液1后，BDNF和NGF表達量明顯降低，隨著誘導液2及誘導液3的依次添加，BDNF和NGF的表達量逐漸升高，且濃度明顯高于hAMSCs培養(yǎng)6d組，說明在誘導分

7、化過程中分泌了大量的BDNF和NGF，提供了潛在的促進神經再生的營養(yǎng)支持。
　　3）細胞移植后第2d、5d、7d、9d、14d分別行皮瓣組織免疫熒光染色，iSCs移植組再生神經纖維數(shù)量和直徑均高于hAMSCs移植組。
　　結論：
　　1）胰蛋白酶/膠原酶雙酶消化法可獲得大量的hAMSCs，通過胰酶消化和差速貼壁法，可獲得高純度的hAMSCs；
　　2）分別通過免疫熒光、Western blot、qPCR及ELIS