CGRP在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖中的作用研究.pdf

1、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種在骨組織中廣泛分布的神經(jīng)肽，已發(fā)現(xiàn)，CGRP與骨組織的增殖、塑形密切相關(guān)。通過組織學(xué)研究，在骨折愈合試驗(yàn)中觀察到，骨組織中，含CGRP的神經(jīng)纖維主要分布在骨生成和塑形活躍的區(qū)域，例如在長(zhǎng)骨的干骺端分布就比骨干部位高約10倍，且神經(jīng)分布及CGRP含量的變化與骨折痊愈的過程緊密相關(guān)。研究證實(shí)，CGRP能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)成骨活性。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是成骨細(xì)胞重要的來源干細(xì)胞，也是

2、骨組織工程的主要種子細(xì)胞來源。MSCs的增值能力，直接影響骨的生長(zhǎng)、塑形和修復(fù)，也對(duì)組織工程骨的構(gòu)建效能和成骨能力起著決定性的作用。因此，對(duì)影響MSCs增殖的因素的研究，一直是骨科界和組織工程學(xué)界研究的重點(diǎn)。 目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MSCs在骨組織的分布，主要集中在干骺端的紅骨髓中，這與CGRP能的神經(jīng)分布相符合，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，CGRP能促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞集落的形成。但是關(guān)于CGRP對(duì)MSCs的增殖的影響及其機(jī)制，仍有大量研究需要

3、深入。 第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CGRP受體存在證據(jù) 目的：尋找人骨髓MSCs表面存在CGRP受體的確切證據(jù)(從基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平)。 方法：原材料采自健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細(xì)胞。體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞CGRP受體mRNA表達(dá)檢測(cè)；采用雜交瘤技術(shù)，獲得兔抗人CGRP受體蛋白抗體，利用該抗體，使用Westernblot技術(shù)進(jìn)行MS

4、Cs表達(dá)CGRP受體蛋白檢測(cè)。 結(jié)果：采用梯度離心及貼壁培養(yǎng)篩選，細(xì)胞純度較高，表面標(biāo)記穩(wěn)定，且與文獻(xiàn)報(bào)道相符；經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)人骨髓MSCs表達(dá)CGRP受體mRNA；采用雜交瘤技術(shù)獲得的兔抗人CGRP受體抗體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，滴度較高，能較好的滿足Westernblot試驗(yàn)需要；采用Westernblot的DAB顯色法，檢測(cè)出人MSCs表達(dá)CGRP受體蛋白，且表達(dá)量較大。 結(jié)論：采用梯度離心及貼壁培養(yǎng)法獲得MSC

5、s純度較高，增殖效果穩(wěn)定；經(jīng)過RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)MSCs表達(dá)CGRP受體mRNA:Western-blot檢測(cè)證實(shí)，MSCs表達(dá)CGRP受體蛋白。 第二部分：CGRP對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用 目的：觀察在添加外源性CGRP的情況下，MSCs增殖的改變，并證實(shí)這種改變與添加CGRP間的關(guān)聯(lián)性。 方法：MSCs獲取仍采自健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細(xì)胞。分組采用對(duì)照組、CGRP

6、組(根據(jù)CGRP添加的終濃度分為10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol/L三組)，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線變化；體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，取相同時(shí)相點(diǎn)，光鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察；將各組細(xì)胞在第三代傳代后72小時(shí)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞處在DNA合成期及細(xì)胞分裂前期的比例。 結(jié)果：經(jīng)過對(duì)照培養(yǎng)，細(xì)胞增殖同時(shí)相點(diǎn)，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞密度低于各實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞形態(tài)各組均較為典型、規(guī)則；細(xì)胞周期檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組處于細(xì)胞分

7、裂前期及DNA合成期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組間該比例為，10-8mol/L＞10-9mol/L組＞10-7mol/L，但各實(shí)驗(yàn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MTT組檢測(cè)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各實(shí)驗(yàn)組增殖速率高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖速率為10-8mol/L＞10-9mol/L組＞10-7mol/L。10-8mol/L速率與另外兩實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余兩組間無顯著性差異 結(jié)論：采用MTT法，證實(shí)添加外源性CGRP能促進(jìn)對(duì)數(shù)增殖

8、期MSCs細(xì)胞增殖速度；采用流失細(xì)胞法檢測(cè)，證實(shí)，外源性CGRP能提高M(jìn)SCs細(xì)胞處于DNA合成和有絲分裂前期的比例。 第三部分：CGRP對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的變化的影響的研究 目的：觀察在添加外源性CGRP的情況下，MSCs胞間通訊連接的改變，并驗(yàn)證改變與CGRP的關(guān)聯(lián)性。 方法：MSCs獲取仍采白健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細(xì)胞。分組采用對(duì)照組、CGRP組和拮抗劑組，

9、放射免疫法檢測(cè)各組胞間信號(hào)分子cAMP含量改變；使用CFDA染料，應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞間縫隙連接和胞間信號(hào)傳導(dǎo)能力變化；采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)縫隙連接分子Cx43mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果：放免法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組間，以CGRP組胞間cAMP含量最高，與其余兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CGRP結(jié)合拮抗劑組的含量高于對(duì)照組，后兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用激光共聚焦技術(shù)，結(jié)合CFDA生物活性染料，顯示CGRP組熒光信號(hào)恢復(fù)幅度較對(duì)照組

10、及拮抗劑組大，差異有顯著性(P＜0.05)；拮抗劑組恢復(fù)幅度較對(duì)照組大，但兩組間差異不具有顯著性(P＞0.05)。三組細(xì)胞Cx43mRNA表達(dá)，CGRP組表達(dá)量高于抑制劑組及對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.05)；抑制劑組表達(dá)量高于對(duì)照組，兩者間差異無顯著性。 結(jié)論：CGRP能促進(jìn)MSCs胞間縫隙連接，促進(jìn)縫隙連接蛋白的基因表達(dá)。 第四部分：CGRP對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖相關(guān)因子的作用 目的：研究在添加外源性

11、CGRP的情況下，與MSCs增殖及分化相關(guān)的細(xì)胞因子IGF-1、BMP-2的受體mRNA表達(dá)變化；研究外源性CGRP是否造成MSCs對(duì)成骨誘導(dǎo)因子BMP-2的mRNA表達(dá)。 方法：MSCs獲取、分離及培養(yǎng)方法同前。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、CGRP組和拮抗劑組，采用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)增殖相關(guān)因子IGF-1及其受體mRNA表達(dá)；以及成骨分化因子BMP-2及其受體mRNA表達(dá)。 結(jié)果：采用相對(duì)定量技術(shù)，CGRP組MSCs表達(dá)